Nöron-makrofaj ortak kültürler moleküler faktörler Neurite çıkıntı aktivitesiyle salgılayan makrofajlar etkinleştirmek için
Summary
Geçerli protokol neurite çıkıntı teşvik moleküler faktörler serbest bırakmak için kapasite ile donatılmış için kültürlü makrofajlar uyarmak için deneysel yordamları sunar. Nöron-makrofaj ortak kültürler kampa tedavisinde makrofajlar güçlü neurite çıkıntı faaliyet sahip klimalı orta üretmek için neden olmaktadır.
Abstract
Makrofajlar rejenerasyon veya onarım yaralı sinir sisteminin katılabilir güçlü kanıtlar var. Burada, bir protokol makrofajlar neurite çıkıntı teşvik şartına üretim ortamına (CM) indüklenir açıklayın. Yetişkin dorsal kök gangliyon (DRG) neurons Akut ayrışmış ve kaplama. Nöronlar stabil ilişik sonra Periton makrofajlar ortak bir hücre kültür eklemek de aynı overlaid kültürlenir. Siklik AMP (db-kampı) için 24 saat, hangi sonra hücre kültürü eklemek makrofajlar içeren ortak kültürler uygulanır Dibutyryl için başka bir şey için 72 h CM toplamak için taşınır. Db-kampıyla ayrı yetişkin DRG nöron kültürü için uygulanan tedavi co kültürlerden CM sağlam neurite yapılan etkinlik sergiler. Tek hücre türü yalnız oluşan db kampı tedavi kültürler elde edilen CM, DRG nöron ya da Periton makrofaj, değil sergi neurite yapılan etkinlik. Bu sinir hücreleri ve makrofajlar arasındaki etkileşimi makrofajlar moleküler faktörler ile neurite yapılan faaliyet CM içine salgılayan aktivasyonu için vazgeçilmez olduğunu gösterir. Böylece, bizim ortak kültür paradigma da hücreler arası nöron-makrofaj etkileşiminde pro rejeneratif fenotip ile donatılmış makrofajlar uyarmak için sinyal eğitim yararlı olacaktır.
Introduction
Çalışmalar çeşitli beyin ve omurilik yaralanmaları sonra CNS axon rejenerasyon geliştirmeye çalışmışlardır. İnflamatuar reaksiyonları, kaçınılmaz olarak sinir sisteminde yaralanmalar eşlik eden geleneksel olarak ikincil patolojik süreçler için zararlı sonuçlar1,2önde gelen katılmak için tahmin edilmektedir. Nitekim, inflamatuar reaksiyonları önleyebilirsiniz Metilprednizolon tek onaylı tedavisi akut omurilik yaralanması3için olduğunu. Bununla birlikte, daha yeni çalışmalar makrofajlar, temsilcisi inflamatuar hücre tipi, rejenerasyon veya onarım yaralı sinir sistemi4,5,6katılabilir kanıt sağlamış. Örneğin, retina ganglion sinir hücreleri7,8rejenerasyon tanıtmak için bir lens yaralanma üretmek pro rejeneratif molekülleri takip makrofajlar sızmak. Buna ek olarak, transplante DRG nöronlar tarafından zymosan9makrofajlar etkinleştirdiğiniz yere bölge axon büyümesini arttı. Ayrıca, lezyon sitesinde makrofajlar yaralı periferik sinirler10büyüme izin veren bir ortam oluşturabilirsiniz.
Çalışmalarımız da makrofajlar bitişik nöronlar axon yenilenme kapasitesi katkıda bulunabilir güçlü kanıtlar sağlanan. Dorsal kök gangliyon (DRG) makrofajlar aktivasyonu olduğunu göstermiştir DRG gelişmiş yeniden üretim kapasitesini önemli bir periferik Önkoşullanma takip duyusal sinir hücreleri yaralanma11sinir. Benzer araştırma bağımsız olarak başka bir laboratuvar12den bildirildi. Biz de intraganglionic enjeksiyon dibutyryl siklik AMP (db-kampı), akson rejenerasyon13kapasitesini artırmak için iyi bilinen bir molekül olan makrofajlar Etkinleştirme indüklenen gösterdi. Makrofajlar, etkinliğini db-cAMP etkisi neurite çıkıntı etkinliği kaldırıldı. Sonraki eserler yaralanma kaynaklı ifade CCL2 içinde sinir hücreleri makrofajlar pro rejeneratif fenotip14,15ile uyarmak için bir sinyal olarak tespit edilmiştir.
Yukarıdaki deneysel sonuçlarına göre biz bir preconditioning yaralanma modeli11,14takip DRGs oluşan moleküler olaylarını benzeyen bir vitro modeli kurduk. Bu modelde, db-kampı makrofajlar pro rejeneratif fenotip ile aktivasyonu yol açar sinyal hücreler arası alabilme nöron-makrofaj ortak kültürler uygulanır. Burada, biz hangi tarafından biz moleküler faktörler neurite çıkıntı (şekil 1) teşvik salgılar makrofajlar oluşturabilirsiniz detaylı iletişim kuralları açıklar. Bu deneysel model makrofajlar uyarılmış veya yaralanmalar sinir sistemi için aşağıdaki axon rejenerasyon desteklemek için indüklenen bir kavram gösterilmektedir. Modelimiz da pro rejeneratif makrofajlar harekete geçirmek yol açar hücreler arası sinyal içinde mekanizmaları okumak yararlı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu ortak kültür sistemi oluşturmak için çeşitli kritik adımlar vardır. Fare DRG neurons ve Periton makrofajlar taze hazır sağlamak önemli ve sağlıklı. Tüm DRGs diseksiyon daha–dan 30 dk aldığında azalmış neurite yapılan etkinlik cm yaşadım. Buna ek olarak, Periton makrofajlar bileşenlerinde kan kirlenme de CM neurite çıkıntı etkinliği azalmaya yol açtı. Sağlam nöron-makrofaj etkileşim db-kamp tarafından temin için kapsamlı yıkama Ayrıca doku enkaz tümüyle kaldırılmasını ve si…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu iletişim kuralı bir hibe NMG-2015R1A2A1A01003410 Bilim Bakanlığı, ICT ve gelecek planlama, Kore Cumhuriyeti tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
Referências
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
- Festoff, B. W., et al. Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury. J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).
- Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate. Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).
- Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling. Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).
- DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. Neuroinflammation: the devil is in the details. J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).
- Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).
- Yin, Y., et al. Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration. J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).
- Yin, Y., et al. Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells. Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).
- Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).
- Kwon, M. J., et al. Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury. J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).
- Niemi, J. P., et al. A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration. J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).
- Hannila, S. S., Filbin, M. T. The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).
- Kwon, M. J., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism. Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).
- Cafferty, W. B., et al. Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice. J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).
- Cai, D., et al. Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate. J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).
