Co-cultivos de neurona y macrófagos para activar macrófagos secretando factores moleculares con actividad Neurite consecuencia
Summary
El protocolo actual presenta procedimientos experimentales para estimular macrófagos cultivados para ser dotado de capacidad para liberar factores moleculares que promueven la consecuencia del neurite. Tratamiento de entrenamiento de los co-cultivos de neurona-macrófago induce a los macrófagos para producir medio condicionado que posee fuerte neurite consecuencia actividad.
Abstract
Hay fuerte evidencia que los macrófagos pueden participar en la regeneración o la reparación del sistema nervioso lesionado. Aquí, describimos un protocolo en el que los macrófagos son inducidos a producir acondicionado medio (CM) que promueve la consecuencia del neurite. Las neuronas del ganglio (DRG) de adultos raíz dorsal agudo disociadas y plateadas. Después de que las neuronas se unen estable, macrófagos peritoneales son cultivados conjuntamente en una inserción de cultura celular superpuesta en el mismo bien. Cyclophosphate que amperio cíclico (campo de la db) se aplica a las culturas Co durante 24 h, después de que el cultivo celular insertar que contiene los macrófagos se traslada a otro pozo para recoger CM 72 h. La CM de los co-cultivos tratados con db-campamento, cuando se aplica a una cultura de neurona adulta independiente DRG, muestra robusta neurite consecuencia actividad. Los CM Obtenido de los cultivos tratados con db y campamento que consta de un solo tipo de células sólo, neurona DRG o macrófago peritoneal, no mostró actividad de consecuencia del neurite. Esto indica que la interacción entre las neuronas y los macrófagos es indispensable para la activación de los macrófagos que secretaban factores moleculares con actividad de consecuencia del neurite en CM. Así, nuestro paradigma de la cultura también será útil para el estudio de señalización intercelular en la interacción macrófago-neurona para estimular a los macrófagos a ser dotado de un fenotipo pro-regenerativa.
Introduction
Una variedad de estudios han intentado mejorar la regeneración del axon de CNS después de las lesiones de la médula espinal o el cerebro. Las reacciones inflamatorias, que inevitablemente acompaña a las lesiones en el sistema nervioso, tradicionalmente se cree que participan en procesos patológicos secundarios conduce a resultados deletéreos de1,2. De hecho, metilprednisolona que puede suprimir las reacciones inflamatorias es la única terapia aprobada para lesiones de médula espinal aguda3. Sin embargo, estudios más recientes han proporcionado evidencia que los macrófagos, un tipo de célula inflamatoria representante, pueden participar en la regeneración o la reparación del sistema nervioso lesionado4,5,6. Por ejemplo, infiltrarse en los macrófagos tras un lente lesiones producen pro renovables las moléculas para promover la regeneración de las neuronas ganglionares de la retina7,8. Además, trasplantado las neuronas DRG aumentaron en el crecimiento del axón hasta la región donde fueron activados los macrófagos por el zymosan9. Por otra parte, los macrófagos en el sitio de la lesión pueden crear un entorno permisivo crecimiento de nervios periféricos lesionados10.
Nuestro trabajo también proporcionó evidencia fuerte que los macrófagos pueden contribuir a la capacidad de regeneración de axones en las neuronas adyacentes. Hemos demostrado que la activación de los macrófagos en los ganglios de raíz dorsal (GRD) es esenciales para mejorar la capacidad regenerativa de DRG neuronas sensoriales siguiendo un preacondicionamiento periférica del nervio lesión11. Una investigación similar fue reportada independientemente de otro laboratorio12. También demostramos que intraganglionic inyección de cyclophosphate amperio cíclico (campo de db), que es una molécula conocida para mejorar la capacidad de regeneración del axón13, inducida por la activación de los macrófagos. La desactivación de los macrófagos suprimió los efectos de la db-campo de actividad de consecuencia del neurite. Obras posteriores identificaron expresión inducida por la lesión de CCL2 en las neuronas como una señal para estimular macrófagos con un fenotipo pro-regenerativa14,15.
Basado en los resultados experimentales anteriores, hemos establecido un modelo en vitro que se asemeja a los eventos moleculares que ocurren en los DRGs siguiendo un preacondicionamiento lesiones modelo11,14. En este modelo, db-campo se aplica a las neurona-macrófago co-cultivos obtención de señalización que conduce a la activación de macrófagos con un fenotipo pro-regenerativa intercelular. Aquí, describimos protocolos detallados que podemos generar los macrófagos que secretan factores moleculares que promueven neurite consecuencia (figura 1). Este modelo experimental ilustra un concepto que los macrófagos pueden ser estimulados o inducidos para apoyar la regeneración del axón siguiendo las lesiones al sistema nervioso. Nuestro modelo también será útil en el estudio de mecanismos de señalización intercelular que conduce a la activación de los macrófagos pro-regenerativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios pasos fundamentales para la generación de este sistema de co-cultivo. Es importante asegurarse de que las neuronas de ratón DRG y macrófagos peritoneales están preparados frescos y saludables. Hemos experimentado disminución neurite consecuencia actividad del CM cuando la disección de los DRGs tomó más de 30 minutos. Además, la contaminación de los componentes de la sangre en los macrófagos peritoneales también condujo a una disminución de la actividad de consecuencia del neurite en el CM. Con el …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este protocolo es apoyado por una subvención de NRF-2015R1A2A1A01003410 del Ministerio de ciencia, TIC y planeación de futuro, República de Corea.
Materials
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
Referências
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