Нейрон макрофагального Сопредседатель культур для активации макрофагов, секретирующих молекулярные факторы с Neurite результатом деятельности
Summary
Текущий протокол представляет экспериментальные процедуры для стимулирования культивировали макрофаги быть наделен способность освободить молекулярные факторы, которые способствуют neurite нарост. Лечение лагеря нейрон макрофагального Сопредседатель культур индуцирует макрофаги производить кондиционером среда, которая обладает сильным neurite результатом деятельности.
Abstract
Существует убедительные доказательства того, что макрофаги могут участвовать в регенерации или ремонт пострадавшего нервной системы. Здесь мы описываем протокол, в котором макрофаги вынуждены производят кондиционером среднего (см), что способствует neurite нарост. Взрослый Спинной корень нейроны ганглии (DRG) остро в отрыве и покрытием. После того, как нейроны стабильно прикреплены, перитонеальных макрофагов совместно культивируемых на вставке культуры клеток, накладывается на то же хорошо. Иммунобиологический циклических AMP (db лагерь) применяется для совместного культур за 24 ч, после чего содержащий макрофаги вставить культуры клеток перемещается в другой хорошо для сбора см за 72 ч. СМ от совместного культур, относились с db лагерь, когда применяется к культуре, нейрон отдельный взрослый DRG, экспонаты надежные neurite результатом деятельности. СМ, полученные из db лагерь лечение культур, состоящий из одной ячейки типа только, DRG нейрон или перитонеальных макрофагов, не проявляют neurite активность нарост. Это означает, что взаимодействия между нейронами и макрофагами незаменима для активации макрофагов, секретирующих молекулярные факторы с neurite результатом деятельности см. Таким образом наш парадигмы сотрудничества культуры также будет полезным для изучения межклеточной сигнализации в нейрон макрофагального взаимодействия стимулировать макрофаги быть наделен про восстановительной фенотип.
Introduction
Целый ряд исследований стремились к повышению регенерации аксона ЦНС после травмы спинного или головного мозга. Воспалительные реакции, неизбежно сопутствующих травм нервной системы, традиционно считаются участвовать в вторичной патологических процессов, ведущих к пагубным результатам1,2. Действительно метилпреднизолон, который может подавить воспалительные реакции является только утвержденные терапия острого спинного мозга травмы3. Однако более поздние исследования представили доказательства того, что макрофаги, представитель воспалительных клеток типа, могут участвовать в регенерации или ремонт пострадавшего нервной системы4,5,6. Например проникнув макрофаги после про восстановительной молекул объектив травмы производят регенерации сетчатки ганглия нейронов7,8. Кроме того пересаженные нейроны DRG увеличение роста аксона до региона, где были активированы макрофаги, zymosan9. Кроме того макрофаги в месте поражения можно создать роста разрешительной окружение для10раненых периферических нервов.
Наша работа также представил сильные доказательства того, что макрофаги могут способствовать способности регенерации аксона в соседних нейронов. Мы показали, что активация макрофагов в спинной корень ганглиев (DRG) были в расширенной регенеративной способностью DRG сенсорных нейронов после предварительной подготовки периферической нерв травмы11. Подобные исследования сообщили независимо от другой лаборатории12. Мы также показали, что intraganglionic инъекции иммунобиологический ЦАМФ (db лагерь), который является известным молекулы для повышения способности регенерации аксона13, индуцированной активации макрофагов. Деактивация макрофаги отменил эффекты db лагерь на neurite нарост активность. Последующие работы определены травмы индуцированной выражение CCL2 в нейронах как сигнал для стимулирования макрофагов с про восстановительной фенотип14,15.
На основании выше экспериментальные результаты, мы создали модель в пробирке , напоминающие молекулярные события, которые происходят в ДРГ после предварительной травмы модель11,14. В этой модели db лагерь применяется к нейрон макрофагального Сопредседатель культур, вызывая межклеточной сигнализации, что приводит к активации макрофагов с про восстановительной фенотип. Здесь мы описываем подробные протоколы, по которым мы можем генерировать макрофаги, которые выделяют молекулярные факторы, содействующие нарост neurite (рис. 1). Эта экспериментальная модель иллюстрирует концепцию, что макрофаги могут быть стимулировали или индуцированной поддержать регенерации аксона после травмы нервной системы. Наша модель будет также полезно в изучении механизмов в межклеточной сигнализации, что приводит к активации про восстановительной макрофагов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует несколько важных шагов для создания этой системы совместного культуры. Это важно обеспечить что мыши DRG нейронов и перитонеальные макрофаги готовятся свежие и здоровые. Мы испытали снижение neurite активности нарост см, когда вскрытие всех ДРГ приняла более 30 мин. Кроме того за?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот протокол поддерживается грантом СР 2015R1A2A1A01003410 из министерства науки, ИКТ и будущего планирования, Республика Корея.
Materials
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
Referências
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
- Festoff, B. W., et al. Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury. J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).
- Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate. Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).
- Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling. Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).
- DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. Neuroinflammation: the devil is in the details. J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).
- Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).
- Yin, Y., et al. Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration. J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).
- Yin, Y., et al. Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells. Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).
- Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).
- Kwon, M. J., et al. Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury. J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).
- Niemi, J. P., et al. A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration. J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).
- Hannila, S. S., Filbin, M. T. The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).
- Kwon, M. J., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism. Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).
- Cafferty, W. B., et al. Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice. J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).
- Cai, D., et al. Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate. J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).
