Neurônio-macrófago co culturas para ativar macrófagos secretando fatores moleculares com axônio consequência atividade
Summary
O protocolo atual apresenta procedimentos experimentais para estimular macrófagos cultivados para ser dotado de capacidade de libertar moleculares fatores que promovem o crescimento do axônio. Tratamento de acampamento para as culturas de macrófagos neurônio co induz os macrófagos para produzir meio condicionado que possui atividade de consequência natural do axônio forte.
Abstract
Há fortes evidências de que os macrófagos podem participar da regeneração ou reparação da lesão de sistema nervoso. Aqui, descrevemos um protocolo em que os macrófagos são induzidos a produzir condicionado médio (CM) que promove o crescimento do axônio. Neurônios do gânglio (DRG) adulto raízes dorsais são agudamente dissociados e chapeados. Depois que os neurônios estão conectados estàvel, macrófagos peritoneais são cultivados co em uma inserção de cultura celular sobreposta sobre o mesmo bem. Dibutyryl que amp cíclico (cAMP-db) é aplicado às culturas co por 24 h, após o qual a cultura de pilha inserir contendo os macrófagos é movido para outro poço para coletar CM por 72 h. O CM de co culturas tratadas com db-cAMP, quando aplicado a uma cultura de neurônio DRG adulta separada, apresenta atividade de consequência natural do axônio robusto. O CM obtido a partir das culturas db-cAMP-tratados, consistindo de um único tipo de células sozinho, ou neurônio DRG ou macrófago peritoneal, não apresentam atividade de consequência axônio. Isso indica que a interação entre os neurônios e macrófagos é indispensável para a ativação de macrófagos secretando fatores moleculares com atividade de consequência natural do axônio em centímetros. Assim, nosso paradigma de co-cultura também será útil para estudar a sinalização intercelular na interação neurônio-macrófago para estimular os macrófagos para ser dotado de um fenótipo pro-regenerativa.
Introduction
Diversos estudos têm buscado melhorar a regeneração de axônio CNS após as lesões da medula espinhal ou cérebro. Reações inflamatórias, inevitavelmente, que acompanham as lesões no sistema nervoso, tradicionalmente são pensadas para participar em processos patológicos secundários, levando a resultados deletérios1,2. Com efeito, metilprednisolona que pode suprimir reações inflamatórias é a única terapia aprovada para de lesão medular aguda3. No entanto, estudos mais recentes forneceram evidências que macrófagos, um tipo de células inflamatórias representativo, podem participar da regeneração ou reparação da lesão de sistema nervoso4,5,6. Por exemplo, infiltração de macrófagos que seguindo uma lente lesão produzir pro-regenerativa as moléculas para promover a regeneração de neurônios ganglionares da retina7,8. Além disso, transplantados neurônios DRG aumentaram o crescimento do axônio na região onde os macrófagos foram activados por ZnPPIX9. Além disso, os macrófagos, no local da lesão podem criar um meio de crescimento-permissivo por nervos periféricos feridos10.
Nosso trabalho também forneceu fortes evidências que os macrófagos podem contribuir para a capacidade de regeneração do axônio nos neurônios adjacentes. Temos demonstrado que a ativação de macrófagos no gânglio da raiz dorsal (DRG) foram essenciais na reforçada capacidade regenerativa de DRG neurônios sensoriais seguindo um pré-condicionamento periférica nervo lesão11. Pesquisa semelhante foi relatada independentemente de outro laboratório12. Também mostramos que a injeção intraganglionic de dibutyryl do AMP cíclico (cAMP-db), que é uma molécula bem conhecida para aumentar a capacidade de regeneração do axônio13, induziu a ativação de macrófagos. A desativação de macrófagos aboliu os efeitos da db-acampamento na atividade de consequência natural do axônio. Trabalhos posteriores identificaram induzida por lesão expressão CCL2 nos neurônios como um sinal para estimular macrófagos com fenótipo regenerativos pro14,15.
Com base em resultados experimentais acima, nós estabelecemos um modelo in vitro assemelhando-se a eventos moleculares que ocorrem nos DRGs seguindo um pré-condicionamento lesão modelo11,14. Neste modelo, db-cAMP é aplicado para as culturas co neurônio-macrófago provocando intercelular de sinalização que leva à ativação de macrófagos com um fenótipo pro-regenerativa. Aqui, descrevemos protocolos detalhados, pelo qual podemos gerar os macrófagos que secretam fatores moleculares promovendo consequência axônio (Figura 1). Este modelo experimental ilustra um conceito que macrófagos podem ser estimulados ou induzidos a apoiar a regeneração do axônio após as lesões ao sistema nervoso. Nosso modelo também será útil no estudo de mecanismos de sinalização intercelular que leva à ativação de macrófagos pro-regenerativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem várias etapas críticas para a geração deste sistema de co-cultura. É importante assegurar que os neurônios de rato DRG e macrófagos peritoneais são preparados frescos e saudáveis. Nós experimentamos o axônio reduzida atividade de consequência natural do CM quando a dissecação de todos os DRGs levou mais de 30 min. Além disso, a contaminação dos componentes do sangue em macrófagos peritoneais também levou a uma diminuição da atividade de consequência natural do axônio no CM. Lavagem completa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este protocolo é suportado por um fundo NRF-2015R1A2A1A01003410 do Ministério da ciência, TIC e planejamento futuro, República da Coreia.
Materials
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
Referências
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