Nevron-Macrophage co kulturer å aktivere makrofager sekresjon molekylær faktorer med Neurite utvekst aktivitet
Summary
Gjeldende protokollen presenterer eksperimentelle prosedyrer for å stimulere kulturperler makrofager å være utstyrt med evne til å slippe molekylær faktorer som fremmer neurite utvekst. Behandling av Nevron-macrophage co kulturer induserer makrofager å produsere betinget medium som besitter sterke neurite utvekst aktivitet.
Abstract
Det er sterke bevis for at makrofager kan delta i gjenfødelse eller reparasjon av skadet nervesystemet. Her beskriver vi en protokoll som makrofager hjulpet produsere betinget medium (CM) som fremmer neurite utvekst. Voksen dorsal root ganglion (DRG) neurons er akutt avstand og belagt. Etter neurons knyttes stabilt, er peritoneal makrofager co kultivert på en celle kultur setter kledde på samme godt. Dibutyryl syklisk AMP (db-cAMP) gjelder co kulturer 24 h, som i cellekultur sett som inneholder makrofagene flyttes til et annet godt å samle CM 72 h. CM fra co kulturer behandlet med db-leiren når en separat voksen DRG Nevron kultur, utstillinger robust neurite utvekst aktivitet. CM fra db-cAMP-behandlet kulturer som består av én celle type alene, DRG Nevron eller peritoneal macrophage, ikke viser neurite utvekst aktivitet. Dette angir at samspillet mellom nerveceller og makrofager er uunnværlig for aktivering av makrofager sekresjon molekylær faktorer med neurite utvekst aktivitet i CM. Dermed vil vår co kultur paradigme også være nyttig å studere intercellulære signalering i Nevron-macrophage samspillet å stimulere makrofager å være utstyrt med en pro-regenerativ fenotypen.
Introduction
En rekke studier har søkt å forbedre CNS axon regenerering etter skader i ryggmargen eller hjernen. Inflammatoriske reaksjoner, uunngåelig medfølgende skader på nervesystemet, er tradisjonelt tenkt å delta i sekundære patologisk prosesser fører til skadelige resultater1,2. Metylprednisolon som kan undertrykke inflammatoriske reaksjoner er faktisk den eneste godkjente terapien for akutt ryggmargen skaden3. Nyere studier har imidlertid gitt bevis at makrofager, en representant inflammatorisk celle type, kan delta i gjenfødelse eller reparasjon av skadet nervesystemet4,5,6. For eksempel infiltrere makrofager etter en linse skade produsere pro-regenerativ molekyler å fremme regenerering av netthinnen ganglion neurons7,8. I tillegg økt transplantert DRG neurons axon vekst opp regionen der makrofager ble aktivert ved zymosan9. Videre kan makrofager på webområdet lesjon opprette en vekst-ettergivende miljøet for skadde perifere nerver10.
Vårt arbeid også gitt sterke bevis som makrofager kan bidra til kapasiteten til axon gjenfødelse tilstøtende neurons. Vi har vist at aktivering av makrofager i dorsal root Ganglion (DRG) var avgjørende for forbedret regenerativ kapasitet DRG sensoriske neurons etter en preconditioning eksterne nerve skade11. Lignende forskning ble uavhengig rapportert fra en annen laboratorium12. Vi viste også at intraganglionic injeksjon av dibutyryl syklisk AMP (db-cAMP), som er et velkjent molekyl å styrke kapasiteten til axon gjenfødelse13, indusert aktivering av makrofager. Deaktivering av makrofager avskaffet effekten av db-leiren på neurite utvekst aktivitet. Etterfølgende verk identifisert skade-indusert uttrykk for CCL2 i nerveceller som et signal å stimulere makrofager med en pro-regenerativ fenotypen14,15.
Basert på ovennevnte eksperimentelle resultatene, har vi etablert en i vitro modell ligner molekylære hendelser som oppstår i DRGs etter en preconditioning skade modellen11,14. I denne modellen brukes db-cAMP Nevron-macrophage co kulturer fremlokkende intercellulære signalering som fører til aktivering av makrofager med en pro-regenerativ fenotypen. Her beskriver vi detaljerte protokoller som vi kan generere makrofager som skiller molekylær faktorer fremme neurite utvekst (figur 1). Denne eksperimentelle modellen illustrerer et konsept som makrofager kan stimulert eller indusert støtte axon regenerering etter skadene til nervesystemet. Vår modell vil også være nyttig i å studere mekanismer i intercellulære signalering som fører til aktivering av pro-regenerativ makrofager.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er flere viktige skritt for generering av denne co kultur-systemet. Det er viktig å sikre at musen DRG neurons og peritoneal makrofager tilberedes på frisk og sunn. Vi har opplevd redusert neurite utvekst aktivitet i CM når Disseksjon av alle DRGs tok mer enn 30 min. I tillegg forurensning av blod komponenter i peritoneal makrofager også ført til en reduksjon av neurite utvekst aktivitet i CM. For å lokke fram robust Nevron-macrophage samspillet av db-cAMP, grundig vask vil også være et kritisk steg til fulls…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne protokollen støttes av en bevilgning NRF-2015R1A2A1A01003410 fra departementet for vitenskap, IKT og fremtiden planlegging, Sør-Korea.
Materials
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
Referências
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
- Festoff, B. W., et al. Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury. J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).
- Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate. Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).
- Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling. Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).
- DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. Neuroinflammation: the devil is in the details. J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).
- Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).
- Yin, Y., et al. Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration. J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).
- Yin, Y., et al. Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells. Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).
- Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).
- Kwon, M. J., et al. Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury. J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).
- Niemi, J. P., et al. A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration. J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).
- Hannila, S. S., Filbin, M. T. The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).
- Kwon, M. J., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism. Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).
- Cafferty, W. B., et al. Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice. J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).
- Cai, D., et al. Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate. J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).
