アクティブに大食細胞の神経突起伸展作用と分子因子を分泌する神経細胞・ マクロファージ共培養
Summary
現在のプロトコルは、神経突起伸長を促進する因子の分子を解放する能力が備わっている培養マクロファージを刺激する実験の手順を示します。神経細胞・ マクロファージの共培養にキャンプの治療は、強力な神経突起伸長作用を有している馴化培地を生成するマクロファージを誘導します。
Abstract
マクロファージが再生または負傷した神経系の修復に参加できることを強力な証拠があります。ここでは、マクロファージ、神経突起伸長を促進するエアコン生産媒体 (CM) に誘導されるプロトコルについて述べる。大人の後根神経節 (DRG) ニューロンは急性解離、メッキします。ニューロンは接続安定、マクロファージが文化のセル挿入も同じにオーバーレイで共培養です。サイクリック AMP (db キャンプ)、24 h、その後細胞培養は大食細胞を含む挿入の共培養に適用されます調節は 72 h の CM を収集する別よくに移動されます。共培養別アダルト後根神経節ニューロンの文化に適用されるとき、db キャンプで治療から CM は、堅牢な神経突起伸長活性を発揮します。単一のセルの種類だけから成る db キャンプ治療文化から得られる CM、DRG ニューロンまたは腹腔マクロファージ、神経突起伸長活性に表わさなかった。これは、神経細胞とマクロファージの相互作用はない CM に神経突起伸長活性分子因子を分泌するマクロファージの活性化のため不可欠であることを示します。したがって、私たちの共培養のパラダイムは、恵まれているプロ再生表現型マクロファージを刺激する神経細胞・ マクロファージの相互作用における細胞間情報伝達の研究に有用もなります。
Introduction
負傷後脊髄や脳の中枢神経系軸索の再生を高めるために様々 な研究を求めています。炎症反応、神経系に傷害を必然的に伴う伝統的成果劇物1,2につながる二次の病理学プロセスに参加する考えられています。確かに、炎症反応を抑制するステロイドは急性脊髄傷害3の唯一の承認された治療です。しかしより最近の研究では、マクロファージ、代表的な炎症性細胞の種類が再生または負傷した神経系4,5,6の修復に参加できることを証拠を提供しています。たとえば、浸潤マクロファージ網膜神経節ニューロン7,8の再生を促進させるレンズ損傷生成プロ再生分子を次します。さらに、移植後根神経節ニューロンは、マクロファージがザイモサン9によってアクティブ化されている領域を軸索成長を増加しました。また、病変のサイトでマクロファージは、傷ついた末梢神経10成長寛容な環境を作成できます。
私たちの仕事は、マクロファージは、隣接するニューロンの軸索再生の能力に貢献できる強力な証拠も提供。後根神経節 (DRG) におけるマクロファージの活性化が示されている DRG の強化された再生能力に不可欠な感覚ニューロンの前処理末梢神経傷害11。同様の研究は独立して別の所12から報告。また、軸索再生13の能力を強化するよく知られている分子である amp (db キャンプ)、intraganglionic 注射誘発マクロファージの活性化したことを示した。マクロファージの非アクティブ化は、神経突起伸長活性に及ぼす db キャンプを廃止しました。後続の作品は、傷害による発現 CCL2 ニューロンのプロ再生表現型14,15マクロファージを刺激するために信号として識別されます。
上記の実験結果に基づき, 前処理傷害モデル11,14以降 drg コードで発生する分子のイベントに似た生体外モデルを設けています。このモデルでは、db-キャンプはプロ再生表現型とマクロファージの活性化につながるシグナル伝達細胞間を引き出す神経細胞・ マクロファージの共培養に適用されます。ここでは、我々 は我々 が神経突起伸展 (図 1) を促進する分子の要因を分泌するマクロファージを生成できます詳細なプロトコルを説明します。この実験モデルは、マクロファージを刺激または傷害神経系の軸索再生をサポートに誘導できるコンセプトを示しています。我々 のモデルはプロ再生マクロファージの活性化につながる細胞間情報伝達機構の勉強に役に立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この共培養システムの生成のいくつかの重要な手順があります。マウス後根神経節ニューロンと腹腔マクロファージが新鮮な準備されていることを確認することが重要であり、健康です。我々 はすべての Drg の郭清を 30 分以上取ったとき CM の減少した神経突起伸長活性を経験しています。さらに、マクロファージの血液成分の汚染はまた CM の神経突起伸長活性の減少につながった。Db キャ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロトコルは、NRF-2015R1A2A1A01003410 科学省、ICT および将来計画、韓国政府からの助成金によってサポートされます。
Materials
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
Referências
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
- Festoff, B. W., et al. Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury. J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).
- Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate. Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).
- Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling. Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).
- DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. Neuroinflammation: the devil is in the details. J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).
- Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).
- Yin, Y., et al. Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration. J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).
- Yin, Y., et al. Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells. Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).
- Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).
- Kwon, M. J., et al. Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury. J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).
- Niemi, J. P., et al. A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration. J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).
- Hannila, S. S., Filbin, M. T. The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).
- Kwon, M. J., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism. Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).
- Cafferty, W. B., et al. Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice. J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).
- Cai, D., et al. Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate. J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).
