न्यूरॉन-मैक्रोफेज सह संस्कृतियों सक्रिय करने के लिए मैक्रोफेज Neurite के साथ आणविक कारकों स्रावित गतिविधि
Summary
मौजूदा प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को प्रोत्साहित करने के लिए मैक्रोफेज को उत्तेजित करने के लिए आणविक कारकों है कि neurite वृद्धि को बढ़ावा देने के रिलीज की क्षमता के साथ संपंन हो । शिविर के ंयूरॉन-मैक्रोफेज सह संस्कृतियों के उपचार के लिए वातानुकूलित माध्यम है कि मजबूत neurite वृद्धि गतिविधि के पास उत्पादन मैक्रोफेज लाती है ।
Abstract
वहां मजबूत सबूत है कि मैक्रोफेज पुनर्जनन या घायल तंत्रिका तंत्र की मरंमत में भाग ले सकते है । यहां, हम एक प्रोटोकॉल जिसमें मैक्रोफेज वातानुकूलित मध्यम (सेमी) है कि neurite वृद्धि को बढ़ावा देने के उत्पादन के लिए प्रेरित कर रहे है का वर्णन । वयस्क पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि (डीआरजी) न्यूरॉन्स तीव्रता से असंबद्ध और चढ़ाया जाता है. के बाद ंयूरॉंस छुरा संलग्न हैं, पेरिटोनियल मैक्रोफेज सह रहे है एक सेल संस्कृति पर एक ही अच्छी तरह से मढ़ा डालने पर संस्कृति । Dibutyryl चक्रीय AMP (डीबी-शिविर) 24 ज के लिए सह संस्कृतियों के लिए लागू किया जाता है, जिसके बाद कोशिका संस्कृति मैक्रोफेज युक्त सम्मिलित करने के लिए एक और अच्छी तरह से ले जाया जाता है 72 एच के लिए मुख्यमंत्री इकट्ठा. सह से CM-संस्कृतियों डीबी के साथ इलाज शिविर, जब एक अलग वयस्क डीआरजी ंयूरॉन संस्कृति के लिए आवेदन किया, मजबूत neurite वृद्धि गतिविधि दर्शाती है । डीबी-शिविर से प्राप्त मुख्यमंत्री अकेले एकल कोशिका प्रकार से मिलकर संस्कृतियों का इलाज किया, या तो डीआरजी ंयूरॉन या पेरिटोनियल मैक्रोफेज, प्रदर्शन neurite वृद्धि गतिविधि नहीं था । यह इंगित करता है कि न्यूरॉन्स और मैक्रोफेज के बीच बातचीत सेमी में neurite वृद्धि गतिविधि के साथ आणविक कारकों स्रावित मैक्रोफेज के सक्रियकरण के लिए अपरिहार्य है. इस प्रकार, हमारे सह संस्कृति प्रतिमान भी एक प्रो-अपक्षयी phenotype के साथ संपंन होने के लिए मैक्रोफेज को उत्तेजित करने के लिए न्यूरॉन-मैक्रोफेज बातचीत में सेलुलर संकेतन अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो जाएगा.
Introduction
अध्ययनों की एक किस्म के लिए रीढ़ की हड्डी या मस्तिष्क की चोटों के बाद सीएनएस axon पुनर्जनन बढ़ाने की मांग की है । भड़काऊ प्रतिक्रियाओं, अनिवार्य रूप से तंत्रिका तंत्र में चोटों के साथ, पारंपरिक रूप से माध्यमिक रोग प्रक्रियाओं बचके परिणाम1,2के लिए अग्रणी में भाग लेने के लिए सोचा है । दरअसल, methylprednisolone कि भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को दबा सकते हैं तीव्र रीढ़ की हड्डी की चोट के लिए केवल अनुमोदित चिकित्सा है3। हालांकि, अधिक हाल के अध्ययनों से सबूत प्रदान किया है कि मैक्रोफेज, एक प्रतिनिधि भड़काऊ सेल प्रकार, पुनर्जनन या घायल तंत्रिका प्रणाली की मरंमत में भाग ले सकते है4,5,6। उदाहरण के लिए, एक लेंस की चोट के बाद मैक्रोफेज घुसपैठ प्रो-अपक्षयी अणुओं रेटिना नाड़ीग्रंथि न्यूरॉन्स7के उत्थान को बढ़ावा देने के लिए उत्पादन,8. इसके अलावा, प्रत्यारोपित डीआरजी ंयूरॉंस क्षेत्र जहां मैक्रोफेज zymosan9द्वारा सक्रिय किया गया ऊपर axon वृद्धि हुई । इसके अलावा, घाव साइट पर मैक्रोफेज एक विकास बना सकते हैं-घायल परिधीय नसों के लिए स्वतंत्र वातावरण10.
हमारे काम भी मजबूत सबूत है कि मैक्रोफेज से सटे न्यूरॉन्स में axon पुनर्जनन की क्षमता के लिए योगदान कर सकते हैं प्रदान की है । हमें पता चला है कि पृष्ठीय रूट गैंग्लिया (डीआरजी) में मैक्रोफेज के सक्रियकरण डीआरजी संवेदी न्यूरॉन्स की बढ़ी अपक्षयी क्षमता में एक जीर्णोद्वार परिधीय तंत्रिका चोट11के बाद आवश्यक थे । इसी तरह के अनुसंधान स्वतंत्र रूप से एक और प्रयोगशाला12से सूचना दी थी । हम यह भी पता चला है कि intraganglionic इंजेक्शन dibutyryl चक्रीय AMP (db-cAMP), जो एक प्रसिद्ध अणु है axon पुनर्जनन13की क्षमता बढ़ाने के लिए, मैक्रोफेज के सक्रियण प्रेरित. मैक्रोफेज की निष्क्रियता db के प्रभाव को समाप्त-neurite वृद्धि गतिविधि पर शिविर । बाद में एक समर्थक के साथ मैक्रोफेज को उत्तेजित करने के लिए एक संकेत के रूप में न्यूरॉन्स में चोट प्रेरित अभिव्यक्ति CCL2 की पहचान की गई काम करता है-पुनर्जन्म phenotype14,15.
इसके बाद के संस्करण प्रयोगात्मक परिणाम के आधार पर, हम एक इन विट्रो मॉडल आणविक घटनाओं है कि एक शर्त चोट मॉडल11,14के बाद DRGs में घटित जैसी स्थापित किया है । इस मॉडल में, डीबी-शिविर न्यूरॉन-मैक्रोफेज सह-एक प्रो-अपक्षयी phenotype के साथ मैक्रोफेज के सक्रियण की ओर जाता है कि सेलुलर संकेत देने संस्कृतियों के लिए लागू किया जाता है. यहां, हम विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है जिसके द्वारा हम मैक्रोफेज उत्पंन कर सकते है कि आणविक neurite वृद्धि को बढ़ावा देने के कारकों का स्राव (चित्रा 1) । इस प्रयोगात्मक मॉडल एक अवधारणा है कि मैक्रोफेज उत्तेजित या तंत्रिका तंत्र के लिए चोटों के बाद axon पुनर्जनन समर्थन प्रेरित किया जा सकता है दिखाता है । हमारे मॉडल भी सेलुलर संकेत है कि प्रो-अपक्षयी मैक्रोफेज के सक्रियण की ओर जाता में तंत्र का अध्ययन करने में उपयोगी हो जाएगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस सह संस्कृति प्रणाली की पीढ़ी के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हैं । यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि माउस डीआरजी न्यूरॉन्स और पेरिटोनियल मैक्रोफेज तैयार कर रहे हैं ताजा और स्वस्थ. हम जब सभी DRGs के वि?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस प्रोटोकॉल को विज्ञान, आईसीटी और भविष्य की योजना, कोरिया गणराज्य के मंत्रालय से अनुदान एनआरएफ-2015R1A2A1A01003410 द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
Referências
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