Neuron-Makrophagen Ko-Kulturen, Makrophagen sezernieren molekulare Faktoren mit Neuriten Auswuchs Aktivität zu aktivieren
Summary
Das aktuelle Protokoll präsentiert experimentelle Verfahren zur kultivierte Makrophagen, ausgestattet mit einer Kapazität, molekulare Faktoren freizugeben, die Neuriten Auswuchs fördern zu stimulieren. Behandlung des Lagers, das Neuron-Makrophagen Ko-Kulturen induziert die Makrophagen, konditionierten Medium zu produzieren, die starke Neuriten Auswuchs Aktivität besitzt.
Abstract
Es gibt starke Hinweise, dass Makrophagen in der Regeneration oder Reparatur des verletzten Nervensystems teilnehmen können. Hier beschreiben wir ein Protokoll, in dem Makrophagen produzieren konditioniert Medium (CM) induziert werden, die Neuriten Auswuchs fördert. Erwachsenen Dorsal Root Ganglion (DRG) Neuronen sind akut dissoziiert und vernickelt. Nachdem die Neuronen stabil befestigt sind, sind peritoneale Makrophagen Co kultiviert auf einer Zelle Kultur einfügen überlagert, gleich gut. Dibutyryl, das zyklische AMP (Db-cAMP), um die Ko-Kulturen für 24 h angewendet wird, nach denen die Zellkultur einfügen, enthält der Makrophagen wird zu einem anderen verschoben, CM 72 h zu sammeln. CM von der Ko-Kulturen behandelt mit Db-cAMP, angewandt auf eine separate Erwachsenen DRG Neuron Kultur zeigt robuste Neuriten Auswuchs Aktivität. Die CM gewonnen aus der Db-cAMP-behandelten Kulturen bestehend aus einzelnen Zellentyp allein, DRG-Neuronen oder peritonealen Makrophagen nicht Neuriten Auswuchs Aktivität aufweisen. Dies bedeutet, dass die Interaktion zwischen Neuronen und Makrophagen ist unverzichtbar für die Aktivierung von Makrophagen sezernieren molekulare Faktoren mit Neuriten Auswuchs Aktivität in CM. So wird unser Kokultur Paradigma studieren interzelluläre signalisieren in der Neuron-Makrophagen Interaktion stimulieren die Makrophagen, mit einem Pro-regenerative Phänotyp ausgestattet werden auch nützlich.
Introduction
Eine Vielzahl von Studien haben versucht, CNS Axon Regeneration nach Verletzungen des Rückenmarks oder des Gehirns zu verbessern. Entzündliche Reaktionen, zwangsläufig begleitenden Verletzungen des Nervensystems sind traditionell dachte, zur Teilnahme an sekundären pathologischer Prozessen führt zu den schädlichen Ergebnisse1,2. Methylprednisolon, die Entzündungsreaktionen zu unterdrücken, kann nämlich die einzige zugelassene Therapie für akute Rückenmark Verletzungen3. Jedoch haben neuere Studien nachgewiesen, dass Makrophagen, einem repräsentativen entzündliche Zelltyp in der Regeneration oder Reparatur des verletzten Nervensystem4,5,6teilnehmen können. Z. B. infiltrieren Makrophagen nach einem Objektiv Verletzungen produzieren Pro-regenerative Moleküle zu fördern die Regeneration der retinalen Ganglienzellen Neuronen7,8. Darüber hinaus erhöht die transplantierten DRG-Neuronen Axon Wachstum der Region, wo die Makrophagen durch Zymosan9aktiviert wurden. Darüber hinaus können die Makrophagen an der Stelle der Läsion ein Wachstum-freizügigen Milieu für verletzten peripheren Nerven10erstellen.
Unsere Arbeit hat auch starke Beweise, die Makrophagen, die Kapazität der Axon Regeneration im benachbarten Neuronen beitragen können. Wir haben gezeigt, dass die Aktivierung von Makrophagen in den Dorsal Root Ganglien (DRG) wurden wesentlich verbesserte Regenerationsfähigkeit der DRG sensorische Neuronen nach einer Vorkonditionierung peripheren Nerven Verletzung11. Ähnliche Forschungen wurde unabhängig von einem anderen Labor-12berichtet. Wir haben auch gezeigt, dass intraganglionic Injektion von Dibutyryl zyklisches AMP (Db-cAMP), die eine bekannte Molekül, die Kapazitäten der Axon Regeneration13ist, die Aktivierung von Makrophagen induziert. Die Deaktivierung von Makrophagen abgeschafft die Auswirkungen des Db-Camps auf Neuriten Auswuchs Aktivität. Spätere Werke identifiziert Verletzungen-induzierte Expression von CCL2 in Neuronen als Signal zu stimulieren Makrophagen mit einem Pro-regenerative Phänotyp14,15.
Basierend auf den oben genannten experimentellen Ergebnissen, haben wir eine in-vitro- Modell molekularen Ereignisse, die in den DRGs nach ein preconditioning Verletzungen Modell11,14auftreten ähnlich aufgebaut. In diesem Modell wird die Db-cAMP auf der Neuron-Makrophagen Ko-Kulturen entlocken interzelluläre signalisieren, dass das zur Aktivierung von Makrophagen mit einem Pro-regenerative Phänotyp führt angewendet. Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle durch die Makrophagen erzeugen kann, die molekulare Faktoren fördern Neuriten Auswuchs (Abbildung 1) absondern. Dieses experimentelle Modell zeigt ein Konzept, dass Makrophagen können angeregt oder veranlasst, Axon Regeneration nach Verletzungen des Nervensystems zu unterstützen. Unser Modell wird auch bei der Untersuchung der Mechanismen bei der interzellulären Signalisierung, die zur Aktivierung des Pro-regenerativen Makrophagen führt nützlich sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere wichtige Schritte zur Erzeugung von diesem Kokulturen-System. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Maus DRG-Neuronen und peritonealen Makrophagen werden frisch zubereitet und gesund. Verminderte Neuriten Auswuchs Aktivität des CM haben wir erlebt, als das Sezieren von der DRGs mehr als 30 min nahmen. Darüber hinaus führte die Kontamination von Blutbestandteilen in peritonealen Makrophagen auch zu einem Rückgang der Neurit Auswuchs Aktivität der CM. Um robuste Neuron-Makrophagen Interaktion von Db…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Protokoll wird unterstützt durch einen Zuschuss NRF-2015R1A2A1A01003410 vom Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunft planen, Republik Korea.
Materials
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
Referências
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
- Festoff, B. W., et al. Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury. J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).
- Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate. Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).
- Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling. Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).
- DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. Neuroinflammation: the devil is in the details. J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).
- Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).
- Yin, Y., et al. Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration. J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).
- Yin, Y., et al. Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells. Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).
- Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).
- Kwon, M. J., et al. Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury. J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).
- Niemi, J. P., et al. A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration. J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).
- Hannila, S. S., Filbin, M. T. The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).
- Kwon, M. J., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism. Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).
- Cafferty, W. B., et al. Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice. J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).
- Cai, D., et al. Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate. J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).
