Neurone-Macrophage co-cultures d’activer les Macrophages qui sécrètent des facteurs moléculaires avec l’activité des neurites
Summary
Le protocole actuel présente des procédures expérimentales afin de stimuler les macrophages à être doté d’une capacité de libérer les facteurs moléculaires qui favorisent la croissance des neurites. Traitement du cAMP aux cultures neuron-macrophage co induit les macrophages pour produire un milieu conditionné qui possède une activité l’excroissance des neurites forte.
Abstract
Il y a des preuves solides que les macrophages peuvent participer à la régénération ou la réparation des blessés du système nerveux. Nous décrivons ici un protocole dans lequel les macrophages sont induites au moyen de produits conditionnés (CM) qui favorise la croissance des neurites. Neurones ganglionnaires (DRG) adulte de la racine dorsale sont parfaitement dissociées et plaqués. Après que les neurones sont solidement attachés, les macrophages péritonéaux sont conjointement cultivées sur un insert de culture cellulaire superposé sur le même bien. Dibutyryl QU’AMP cyclique (AMPc-db) est appliquée aux cultures co pendant 24 h, après quoi la culture cellulaire insert contenant les macrophages est déplacé vers un autre puits pour recueillir des CM pendant 72 h. Le CM des cultures co traités avec db-cAMP, lorsqu’il est appliqué à une culture de neurone DRG adulte séparée, présente une activité l’excroissance des neurites robuste. Le CM obtenu à partir des cultures traitées db-cAMP constitué de cellules du même type seul, neurone DRG ou macrophages péritonéaux, ne montrent pas d’activité de l’excroissance des neurites. Cela indique que l’interaction entre les neurones et les macrophages est indispensable pour l’activation des macrophages qui sécrètent des facteurs moléculaires avec activité l’excroissance des neurites en CM. Ainsi, notre paradigme de co-culture sera aussi utile pour étudier la signalisation intercellulaire dans les interactions neurone-macrophage pour stimuler les macrophages à être doté d’un phénotype pro-régénérative.
Introduction
Diverses études ont cherché à améliorer la régénération axonale CNS après les blessures de la moelle épinière ou du cerveau. Des réactions inflammatoires, inévitablement accompagnant les lésions du système nerveux, sont traditionnellement perçues comme de participer à des processus pathologiques secondaires menant à des résultats néfastes1,2. En effet, la méthylprednisolone qui peut supprimer les réactions inflammatoires est le seul traitement approuvé pour médullaires graves blessures3. Toutefois, des études plus récentes ont fourni des preuves que les macrophages, un type de cellules inflammatoires représentative, peuvent participer à la régénération ou la réparation du système nerveux lésé4,5,6. Par exemple, infiltration de macrophages suite à une lentille blessure produits pro-régénérative des molécules pour favoriser la régénération des neurones ganglionnaires rétiniennes7,8. En outre, les neurones transplantés de DRG a augmenté la croissance axonale jusqu’à la région où les macrophages activés par zymosan9. En outre, les macrophages à l’emplacement de la lésion peuvent créer un milieu de croissance-permissive pour les nerfs périphériques blessé10.
Notre travail a également fourni des preuves solides que les macrophages peuvent contribuer à la capacité de régénération des axones des neurones adjacents. Nous avons montré que l’activation des macrophages dans les ganglions de la racine dorsale (GRD) ont été essentiels dans la capacité de régénération améliorée des DRG neurones sensoriels, suite à un périphérique de préconditionnement nerf blessures11. Un autre laboratoire12a été signalée indépendamment des recherches similaires. Nous avons également montré que l’injection intraganglionic de dibutyryl AMP cyclique (AMPc-db), qui est une molécule connue pour renforcer la capacité de régénération axonale13, induit l’activation des macrophages. La désactivation des macrophages aboli les effets du db-cAMP sur l’activité de l’excroissance des neurites. Les œuvres ultérieures identifiées expression induite par la blessure de CCL2 dans les neurones comme un signal pour stimuler des macrophages avec un phénotype pro-régénérative14,15.
Basé sur les résultats expérimentaux ci-dessus, nous avons établi un modèle in vitro ressemblant à des événements moléculaires qui interviennent dans les DRGs suite à une blessure préconditionnement modèle11,14. Dans ce modèle, db-cAMP est appliquée aux cultures neuron-macrophage co suscitant intercellulaires de signalisation qui aboutit à l’activation des macrophages avec un phénotype pro-régénérative. Nous décrivons ici les protocoles détaillés par lequel nous pouvons produire des macrophages qui sécrètent des facteurs moléculaires qui favorisent la croissance neuritique (Figure 1). Ce modèle expérimental illustre un concept que macrophages peuvent être stimulées ou amenés à soutenir la régénération axonale après les blessures du système nerveux. Notre modèle sera également utile dans l’étude des mécanismes de signalisation intercellulaire qui aboutit à l’activation des macrophages pro-régénérative.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a plusieurs étapes cruciales pour la génération de ce système de culture mixte. Il est important de s’assurer que les neurones de souris DRG et macrophages péritonéaux sont préparés frais et sain. Nous avons vécu activité l’excroissance des neurites diminuée du CM lors de la dissection des tous les GHM a pris plus de 30 min. En outre, la contamination de produits sanguins labiles dans les macrophages péritonéaux a également conduit à une diminution de l’activité de l’excroissance des neurites…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce protocole est supporté par une subvention de FRO-2015R1A2A1A01003410 du ministère de la Science, TIC et planification Future, République de Corée.
Materials
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
Referências
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