بلعم العصبية الثقافات المشارك لتفعيل الضامة إفراز العوامل الجزيئية مع نشاط ثمرة نورت
Summary
ويقدم البروتوكول الحالي إجراءات تجريبية لحفز الضامة مثقف أن تتمتع بالقدرة على إطلاق سراح الجزيئية العوامل التي تعزز ثمرة نورت. علاج مخيم إلى ثقافات المشارك العصبية-بلعم يستحث الضامة لإنتاج مكيفة المتوسطة التي تمتلك قوي نورت ثمرة النشاط.
Abstract
وهناك أدلة قوية على أن الضامة يمكن المشاركة في تجديد أو إصلاح الجهاز العصبي المصاب. هنا، نحن تصف بروتوكول الذي يتم التي يسببها الضامة إلى متوسط إنتاج مكيفة (سم) يعزز ثمرة نورت. حادة فصل الكبار الظهرية جذر العقدة (DRG) الخلايا العصبية ومطلي. بعد ثابت يتم إرفاق الخلايا العصبية، الضامة البريتوني تربى المشترك على إدراج ثقافة خلية مضافين على نفسه جيدا. يتم نقل ديبوتيريل دوري أمبير (db-مخيم) يتم تطبيقه على ثقافات المشارك ح 24، بعد إدراج ثقافة الخلية تحتوي على الضامة إلى بئر أخرى لجمع سم ح 72. سم من ثقافات المشارك تعامل مع db-مخيم، عندما يطبق على ثقافة العصبية DRG الكبار منفصلة، يسلك نورت قوية ثمرة النشاط. سم تم الحصول عليها من ثقافات db-مخيم-معاملة تتكون من خلية واحدة نوع وحدها، أما من العصبية DRG أو بلعم البريتوني، لا يحمل نورت ثمرة النشاط. وهذا يشير إلى أن التفاعل بين الخلايا العصبية والضامة لا غنى عنها لتفعيل الضامة إفراز العوامل الجزيئية مع نشاط ثمرة نورت في سم. وهكذا، كما ستكون مفيدة لدراسة الإشارات بين الخلايا في التفاعل بلعم العصبية لحفز الضامة أن هبت النمط الظاهري برو-التجدد نموذجنا ثقافة المشارك.
Introduction
مجموعة متنوعة من دراسات سعت إلى تعزيز التجدد إكسون الجهاز العصبي المركزي بعد الإصابات النخاع الشوكي أو الدماغ. ويعتقد تقليديا ردود الفعل الملتهبة، حتما المصاحبة للإصابات في الجهاز العصبي، للمشاركة في العمليات المرضية الثانوية مما يؤدي إلى نتائج ضارة1،2. وفي الواقع، هو methylprednisolone التي يمكن قمع ردود الفعل الملتهبة العلاج المعتمدة فقط ل إصابات النخاع الشوكي الحادة3. ومع ذلك، قدمت دراسات أكثر حداثة الأدلة أن الضامة، نوع خلية الملتهبة ممثل، يمكن المشاركة في تجديد أو إصلاح الجهاز العصبي المصاب4،،من56. على سبيل المثال، تسلل الضامة عقب عدسة إصابة جزيئات برو-التجدد منتجات لتعزيز تجديد العقدة الشبكية العصبية7،8. وبالإضافة إلى ذلك، زيادة زرع الخلايا العصبية DRG إكسون النمو يصل المنطقة حيث تم تفعيل الضامة قبل زيموسان9. وعلاوة على ذلك، يمكن إنشاء الضامة في موقع الآفة بيئة نمو متساهلة لإصابة الأعصاب المحيطية10.
عملنا أيضا قدمت أدلة قوية على أن الضامة يمكن أن تسهم في قدرة التجدد إكسون في الخلايا العصبية المجاورة. وقد أظهرنا أن تم تفعيل الضامة في العقد الجذرية الظهرية (DRG) عنصرا أساسيا في تعزيز قدرة التجدد DRG الخلايا العصبية الحسية عقب preconditioning الطرفية العصبية إصابة11. وذكر إجراء بحوث مماثلة بشكل مستقل من مختبر آخر12. ونحن كما أظهرت أن حقن إينتراجانجليونيك من ديبوتيريل سيكليك أمبير (db-مخيم)، وجزيء معروفة جيدا لتعزيز قدرة التجدد إكسون13، الناجم عن تفعيل الضامة. إبطال مفعول الضامة إلغاء آثار db-مخيم على نورت ثمرة النشاط. وحددت الأعمال اللاحقة التعبير الناجمة عن الإصابة من CCL2 في الخلايا العصبية كإشارة لحفز الضامة مع النمط الظاهري برو-التجدد14،15.
استناداً إلى النتائج التجريبية المذكورة أعلاه، وقد أنشأنا نموذجا في المختبر تشبه الأحداث الجزيئية التي تحدث في باﻷسعار عقب إصابة نموذج11،بريكونديتيونينج14. في هذا النموذج، يتم تطبيق db-مخيم ثقافات المشارك العصبية-بلعم التماس بين الخلايا مما يشير إلى أن يؤدي إلى تفعيل الضامة مع النمط الظاهري برو-التجدد. هنا، نحن وصف مفصل البروتوكولات التي يمكن أن تتولد لدينا الضامة التي تفرز الجزيئية عوامل تعزيز نورت ثمرة (الشكل 1). يوضح هذا النموذج التجريبي من مفهوم أنه يمكن حفز الضامة أو المستحث لدعم التجديد إكسون عقب إصابة الجهاز العصبي. سيكون من المفيد أيضا لنا نموذجا في دراسة الآليات التي تؤدي إلى تفعيل الضامة برو-التجدد في الإشارات بين الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من الخطوات الحاسمة لتوليد هذا النظام الثقافي المشترك. أنها هامة لضمان أن تكون مستعدة بالماوس DRG الخلايا العصبية والضامة البريتوني طازجة وصحية. لقد شهدنا نورت تقلص ثمرة نشاط مجلس الوزراء عند التشريح لجميع باﻷسعار استغرق أكثر من 30 دقيقة. وباﻹضافة إلى ذلك، تلوث مكونات الدم في ال…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا البروتوكول منحة جبهة الخلاص الوطني-2015R1A2A1A01003410 من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات وتخطيط المستقبل، وجمهورية كوريا.
Materials
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
Referências
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
- Festoff, B. W., et al. Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury. J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).
- Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate. Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).
- Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling. Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).
- DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. Neuroinflammation: the devil is in the details. J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).
- Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).
- Yin, Y., et al. Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration. J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).
- Yin, Y., et al. Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells. Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).
- Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).
- Kwon, M. J., et al. Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury. J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).
- Niemi, J. P., et al. A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration. J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).
- Hannila, S. S., Filbin, M. T. The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).
- Kwon, M. J., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism. Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).
- Cafferty, W. B., et al. Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice. J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).
- Cai, D., et al. Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate. J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).
