תא מבחני צבירה כדי להעריך את הכריכה של החריץ דרוזופילה עם טרנס-ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים-ליגנדים
Summary
המורכבות של מערכות ויוו מקשה להבחין בין הפעלת עיכוב של קולטן חריץ על ידי טרנס– ו – cis-ליגנדים, בהתאמה. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מבוסס על במבחנה תא-צבירת מבחני הערכה כמותיים למחצה של הכריכה של חריץ דרוזופילה טרנס-ליגנדים vs cis-ליגנדים.
Abstract
חריץ איתות הינה מערכת תקשורת תא שנשמרת אבולוציונית-תא בשימוש נפוץ חיות פיתוח ותחזוקה למבוגרים. האינטראקציה של הקולטן חריץ עם ליגנדים מגבולות התאים גורם ההפעלה של מסלול איתות (טרנס-הפעלה), תוך אינטראקציה עם ליגנדים מאותו תא מעכב איתות (cis-עיכוב). האיזון הראוי בין הטרנס-הפעלה ו- cis-עיכוב מסייעת בהקמת רמות אופטימלית של חריץ איתות בהקשרים מסוימים במהלך התפתחות בעלי חיים. בגלל על התחומים ביטוי חופפים בין החריץ שלה ליגנדים סוגי תאים רבים על קיום מנגנוני משוב, לומד את ההשפעות של שינוי post-translational נתון על טרנס– לעומת cis-האינטראקציות של דרגה, קשה שלה ליגנדים ויוו . כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור שימוש בתאים דרוזופילה -S2 תא-צבירת מבחני כדי להעריך את ההשפעות של מפילה את צירוף מסלול חריץ על הכריכה של חריץ כדי כל ליגנד טרנס , ב- cis. S2 תאים stably או transiently transfected עם חריץ-להביע וקטור מעורבבים עם תאים לבטא כל ליגנד דרגה (S2-דלתא או מסורית-S2). טרנס-מחייבים בין קולטן ליגנדים גורמת להיווצרות של אגרגטים תא heterotypic, נמדד במונחים של מספר אגרגטים לכל mL המורכב > 6 תאים. כדי לבחון את ההשפעה המעכבת של cis-S2 תאים משותפת להביע חריץ ואת כל ליגנד מעורבבים עם תאים S2-דלתא או S2-מסורית של ליגנדים, המספר של אגרגטים הוא לכמת כמתואר לעיל. הירידה היחסית במספר של אגרגטים בשל נוכחותם של cis-ליגנדים מספק מידה של cis-ליגנד-מתווכת עיכוב של טרנס-איגוד. אלה מבחני פשוטה יכול לספק נתונים כמותיים למחצה על ההשפעות של גנטית או תרופתי מניפולציות על הכריכה של חריץ כדי ליגנדים שלה, יכול לעזור לפענח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס ויוו השפעות כזה מניפולציות על חריץ איתות.
Introduction
איתות חריץ קאנוני הוא מנגנון תקשורת לתא לטווח קצר הדורש מגע פיזי של השכנה תאים כדי להקל על האינטראקציה בין קולטני חריץ שלהם ליגנדים1. האינטראקציה של חריץ קולטן (קיים על פני תאי קליטת אות) עם ליגנדים (בהווה על פני השטח של שליחת אות תאים) יוזם חריץ איתות, המכונה הטרנס-הפעלת2. מצד שני, האינטראקציה בין החריץ שלה ליגנדים באותו התא מוביל אל עיכוב של מסלול חריץ, ידועה בשם cis-עיכוב3. האיזון בין הטרנס– cis-האינטראקציות נדרש כדי להבטיח חריץ תלויות ליגנד-אופטימלי איתות4. דרוזופילה יש קולטן חריץ אחד, שני ליגנדים (דלתא ו Serrate) לעומת יונקים, אשר יש קולטנים דרגה ארבע חמש ליגנדים [משוננים 1 (JAG1), JAG2, כמו דלתא 1 (DLL1), DLL3, DLL4]5. המודל דרוזופילה נתקל הפשטות, מציע את הקלות כדי לנתח/לימוד ההשפעות של מסלול מכפילי על אינטראקציות חריץ-ליגנד ובעקבות כך על חריץ איתות. בהקשרים מסוימים במהלך התפתחות בעלי חיים (כולל אגף פיתוח בדרוזופילה), הן cis– והן הטרנס-האינטראקציות מעורבים איתות חריץ המתאים ושאיפה תא גורל1,6 . חשוב להבחין את ההשפעות של חריץ מכפילי מסלול בהקשרים אלה ב- cis– לעומת הטרנס-האינטראקציות של חריץ עם ליגנדים שלה.
הקבוצה שלנו דיווחו בעבר כי תוספת של משקע פחמימות שנקרא xylose כדי חריץ דרוזופילה שלילית מווסת את חריץ איתות בהקשרים מסוימים, כולל אגף פיתוח7. אובדן שמס (האנזים הזה xylosylates דרגה) שמוביל פנוטיפ “אובדן וריד כנף”7. לאחרונה, ג’ין המינון ניסויים וניתוח המשובטים שימשו כדי להראות כי אובדן שמס מגבירה את חריץ בתיווך דלתא להתמקד. כדי להבחין בין אם באיתות חריץ משופרת במוטציות שמס הוא תוצאה של ירידה cis-עיכוב או מוגבר טרנס-הפעלה, ביטוי חוץ רחמי מחקרים של ליגנדים דרגה ב דיסקים דמותי כנף זחל בוצעו באמצעות מנהל התקן dpp-GAL4 . ניסויים אלה סיפק ראיות שמרמזות על כך שמס מווסת את טרנס-הפעלה של חריץ על ידי דלתא מבלי להשפיע על הרמה cis-עיכוב על ידי ליגנדים8. עם זאת, הזנה-בחזרה תקנות, ההשפעות של ליגנדים אנדוגני עלול לסבך את הפרשנות של ביטוי חוץ רחמי מחקרים1,6,9.
כדי לפתור בעיה זו, תאים S2 דרוזופילה 10 שימשו, אשר מספקים מערכת פשוטה במבחנה חריץ-ליגנד אינטראקציה מחקרים11,12. תאים S2 לא אקספרס אנדוגני חריץ קולטן ו- ליגנד דלתא11 ולבטא רמה נמוכה של מסורית13, אשר אינה משפיעה על הרמה-ליגנד צבירה ניסויים8. לכן, S2 תאים יכולים להיות stably או transiently transfected על ידי חריץ ו/או ליגנדים בודדים (דלתא או Serrate) כדי ליצור תאים המבטאים באופן בלעדי את הקולטן חריץ או באחד ליגנדים שלה, או שילוב של אותם. ערבוב של תאים לבטא חריץ S2 עם הבעת-ליגנד S2 תאים תוצאות להיווצרות של אגרגטים heterotypic מתווכת על-ידי ליגנד קולטן איגוד11,12,14. כימות של היווצרות צבירה מספק מידה של טרנס-מחייב בין החריץ שלה ליגנדים15 (איור 1). באופן דומה, תאים S2 יכול להיות שותף transfected עם ליגנדים חריץ, דלתא או Serrate (דהיינו cis-ליגנדים). Cis-ליגנדים בתאים אלה S2 לבטא חריץ מחסלים. את הכריכה של חריץ עם טרנס-תוצאה של ליגנדים ירד היווצרות הצבירה8,12,14. הירידה היחסית במבנה הצבירה הנגרמת על ידי חבר העמים-ליגנדים מספק מדד ההשפעה המעכבת של cis-ליגנדים על איגוד בין הרמה הטרנס-ליגנדים (איור 2). בהתאם לכך, מבחני צבירת תא נוצלו לבחון את ההשפעה של אובדן xylosylation על טרנס– ו – cis-האינטראקציות בין דרגה ליגנדים שלה.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור תא צבירת מבחני שנועדה להעריך את הכריכה של חריץ עם טרנס-ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים-ליגנדים באמצעות תאים S2 דרוזופילה . לדוגמה, אנו מספקים את הנתונים אפשרה לנו לקבוע את ההשפעה של חריץ xylosylation על איגוד בין הרמה הטרנס-דלתא8. אלה מבחני ישירה לספק הערכה כמותית למחצה של חריץ-ליגנד אינטראקציות במבחנה , לעזור לקבוע את המנגנונים המולקולריים שבבסיס ההשפעות ויוו ממגבילי מסלול חריץ.
Protocol
Representative Results
Discussion
איתות חריץ הקנוני תלוי האינטראקציות בין הקולטן החריץ שלה ליגנדים5. אמנם רוב המחקרים על השביל חריץ לשקול בעיקר הכריכה של חריץ, ליגנדים בתאים הסמוכים (טרנס), דרגה, לאותו תא ליגנדים אינטראקציה, ואת אלה כביכול cis-האינטראקציות יכולים לשחק תפקיד מעכבות בחריץ איתות<sup class="xref"…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים לאשר תמיכה NIH/NIGMS (R01GM084135 כדי HJN), מיזוטני Glycoscience (מענק #110071 HJN), שיטות מודה טום (פ’) לי על דיונים והצעות מבחני, והיסוד ספירו Artavanis-Tsakonas, הוגו Bellen, רוברט פלמינג, קן אירווין, את דרוזופילה גנומיקה משאב מרכז (DGRC) פלסמידים וקווים התא.
Materials
| BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified | Lonza | 04-351Q | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare lifescience | SV30010 | |
| CELLSTAR 6 well plate | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR 24 well plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| VWR mini shaker | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| Hemocytometer | Fisher Sceintific | 267110 | |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision Inverted microscope | VWR | ||
| 9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software | AmScope | MU-900 | Image acquisition using ToupView software |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| Fetal Bovine Serum | GenDepot | F0600-050 | |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| Copper sulphate | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| S2 cells | Invitrogen | R69007 | |
| S2-SerrateTom cells | Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013) | ||
| S2-Delta cells | DGRC | 152 | |
| S2-Notch cells | DGRC | 154 | |
| pMT-Delta vector | DGRC | 1021 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pMT-Serrate vector | Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003) | ||
| pMT-Notch vector | DGRC | 1022 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pAc5.1-EGFP | Gift from Hugo Bellen | ||
| TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit | Applied Biosystem | 1611091 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) | Applied Biosystem | Dm02144576_g1 | with FAM-MGB dye |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) | Applied Biosystem | Dm02151827_g1 | with FAM-MGB dye |
| Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 4351405 | 96-well Block module |
Referências
- de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
- Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).
- del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).
- Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).
- Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).
- Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).
- Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).
- Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).
- Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).
- Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).
- Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).
- Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132 (2), 247-258 (2008).
- Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).
- Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).
