Dit protocol wordt beschreven hoe cellulaire om processen te bestuderen tijdens de cel lot conversie in Caenorhabditis elegans in vivo. Met behulp van transgene dieren, waardoor warmte-schok promotor gestuurde overexpressie van het neuron lot-inducerende transcriptiefactor CHE-1 en RNAi-gemedieerde uitputting van de regulering van de chromatine factor LIN-53 kiem naar neuron herprogrammering waarneembaar in vivo.
Bestuderen van de biologische processen van cel tijdens het converteren van de identiteit van specifieke celtypes biedt belangrijke inzichten in mechanisme die onderhouden en beschermen van cellulaire identiteiten. De omzetting van kiemcellen in specifieke neuronen in de nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een krachtig hulpmiddel voor het uitvoeren van genetische schermen om te ontleden regelgevende trajecten die gevestigde cel identiteiten waarborgen. Herprogrammering van de geslachtscellen tot een specifiek type van neuronen genoemd ASE vereist transgene dieren waarmee brede overmatige expressie van de Zn-vinger transcriptie factor (TF) CHE-1. Endogene CHE-1 wordt uitgedrukt uitsluitend in twee hoofd neuronen en is nodig om het opgeven van het lot van glutamaterge ASE neuronen, die gemakkelijk kan worden gevisualiseerd door de verslaggever van de gcy-5prom::gfp . Een trans-gen met de constructie van de gen expressie voor de warmte-schok-promotor-gedreven che-1 kunt brede mis uitdrukking van CHE-1 in het hele dier op een warmte-shock behandeling. De combinatie van RNAi tegen de regulering van de chromatine factor LIN-53 en warmte-schok-geïnduceerde che-1 overmatige expressie leidt tot herprogrammering van kiemcellen in ASE neuron-achtige cellen. We beschrijven hier de specifieke procedure van RNAi en passende voorwaarden voor warmte-shock behandeling van transgene dieren om met succes het induceren van geslachtscellen naar neuron conversie.
Cel lot herprogrammering door ectopische TF expressie zoals de myogenic TF MyoD, die wanneer overexpressie, bekeerlingen fibroblasten rechtstreeks in de spier-achtige cellen1, een onderzoek-focus voor decennia is geweest. Gedifferentieerde cellen zijn echter vaak vuurvaste aan dit proces, als gevolg van mechanismen die hun cellulaire identiteit waarborgen. Geslachtscellen Toon een vergelijkbare mate van bescherming en er zijn onderliggende mechanismen die vaak als een belemmering fungeren voor het voorkomen van geslachtscellen omzetting in andere celtypes bij overmatige uitdrukking van een lot-inducerende TF. Epigenetische regulatie zoals histone modificaties en de structuur van de chromatine legt doorgaans een belemmering voor de conversie van cel lot2,3. Wij hebben eerder toegepast omgekeerde genetica met behulp van RNAi knock-downs in C. elegans en factoren die beschermen cellulaire identiteiten en daardoor tegengaan herprogrammering van kiemcellen in neuronen4. In het bijzonder de polycomb repressieve complexe 2 (PRC2) en de zeer geconserveerde Histon chaperone LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 bij de mens) te voorkomen dat de directe omzetting van kiemcellen in specifieke somatische celtypen zoals glutamaterge smaak neuronen in C. elegans 4 , 5. om te identificeren deze geslachtscellen herprogrammering barrière factoren, gebruikten we transgene dieren die de warmte-schok afleidbare Zn-vinger TF CHE-1. CHE-1 wordt gewoonlijk uitgedrukt in twee hoofd neuronen van C. elegans, waar het bepaalt dat het lot van glutamaterge smaak neuronen genoemd ASE6. Het ASE neuron lot kan worden gevisualiseerd door expressie van de ASE-specifieke fluorescerende verslaggever gcy-5prom::gfp. GCY-5 is een chemoreceptor alleen uitgedrukt in ASE juiste neuron7. Bij lin-53 uitputting door RNAi en inductie van brede ectopische uitdrukking van CHE-1 door warmte-schok, kan kiemcellen worden omgezet in neuronen in vivo4,5. Bovenal is de timing van RNAi behandeling essentieel aangezien alleen volwassen wormen (P0 generatie) blootgesteld aan lin-53 RNAi aanleiding tot F1 nakomelingen dieren met een germline thats tolerant is geven voor herprogrammering in neuronen4.
De hierboven beschreven kiem naar neuron omzettingsprocedure in C. elegans kan worden gebruikt voor het bestuderen van een verscheidenheid van biologische vragen zoals de implicatie van signalering van opleidingstrajecten in cel lot herprogrammering. Bijvoorbeeld, gebruikten we de kiem CHE-1-geïnduceerde herprogrammering in de neuronen van de ASE op RNAi tegen lin-53 te bestuderen van de gevolgen van de inkeping signalering traject in het proces van herprogrammering8geslachtscellen. Door het uitvoeren van dubbele RNAi om mede afbreken lin-53 en de Histon demethylase-encoding gene utx-1 we bleek dat de inkeping signalering traject tegengaat gene PRC2-gemedieerde monddood maken door het activeren van de expressie van UTX-1 in de kiemcellen8 . Deze bevinding toont aan dat de geslachtscellen conversie naar neuronen beschreven in dit protocol kan worden gebruikt om te bestuderen van een complexe biologisch proces zoals cellulaire herprogrammering in een intact organisme en in het kader van verschillende ontwikkelings- en milieu voorwaarden. Voorts verstrekt het de vooruitzichten om de uitdaging van geslachtscellen door overdreven verschillende lot-inducerende TFs te bestuderen van hun rol bij de beperking van cellulaire plasticiteit9, of om te beoordelen van hun potentieel voor inducerende herprogrammering van kiemcellen te uiten andere cel typt in vivo.
Terwijl zoogdieren weefselcultures toestaan ook bestuderen van de verschillende aspecten van cel lot herprogrammering, hebben cellen gekweekt in cultuur beperkte mogelijkheden om signalering traject omstandigheden ten opzichte van een intact organisme nabootsen. Daarom, C. elegans is een veelzijdig model voor onderzoek van de rol van de verschillende biologische processen zoals Notch signalering tijdens herprogrammering in vivo. Daarnaast is het een krachtig model voor genetische schermen die relatief gemakkelijk te onderhouden en genetisch gewijzigd voor lage kosten.
Terwijl het beschreven protocol gebruikt de transgene C. elegans stam BAT28 en RNAi tegen lin-53 is eenvoudig, een aantal stappen zijn cruciaal om ervoor te zorgen het verwachte resultaat van geslachtscellen naar neuron herprogrammering. Het is belangrijk dat de stam BAT28 te allen tijde voorafgaand aan de experimenten bij 15 ° C wordt gehouden. Tijdens de behandeling en onderhoud van de stam, de tijd bij temperaturen boven de 15 ° C moet worden geminimaliseerd, zoveel mogelijk. Goede warmte-schok voorwaarden zijn belangrijk, omdat onvoldoende inductie van che-1 overexpressie niet in geslachtscellen naar ASE neuron conversie resulteren zal. Dit kan worden gedetecteerd door het meten van het fenotype doordringendheid, zoals beschreven in het protocol. Uitgebreide warmte-schok kan leiden tot letaliteit van de dieren. Bijvoorbeeld ervaren platen die zijn geplaatst in de buurt van de binnenmuren of op de grond van de onderkant van een statische lucht incubator vaak uitgebreide warmtebehandeling. Daarom is het aanbevolen om het gebruik van een incubator ontlucht warmte. Bovendien, is timing van de warmte-schok-inductie van cruciaal belang sinds overmatige uitdrukking van che-1 tijdens de larvale stadia eerder dan L3 tot ectopische gcy-5prom::gfp inductie in verschillende lichaam regio’s zoals de vulva (Figuur 3 leiden kan) 9. Bovendien uitgebreide warmte-schok kan worden gedetecteerd door het fenotype doordringendheid in lege vector RNAi dieren die 5% en verhoogde auto-fluorescentie van andere weefsels, namelijk de darm niet moet uitbreiden.
Sporadisch, kunnen RNAi bacteriën verliezen hun activiteit om efficiënt produceren dsRNA van het target-gen. Helaas, dit kan niet worden gedetecteerd voorafgaand aan het RNAi-experiment. In dergelijke gevallen moet een frisse streep van de glycerol worden gekweekt, zoals beschreven in paragraaf 2 van het protocol. Als er nog geen RNAi veroorzaakte pleiotropic fenotype zichtbaar zoals het fenotype van de pvul veroorzaakt door succesvolle RNAi tegen lin-53, vervolgens een plasmide DNA los van de respectieve bacteriën moet worden uitgevoerd en moeten verse HT115 bacteriën getransformeerd met de plasmide van de L4400 met de volgorde van lin-53 .
Nog belangrijker is, de BAT28-stam heeft een het fenotype van de roller veroorzaakt door de injectie marker pRF4, dat werd gebruikt tijdens Transgenese van de dieren met de hsp-16.2prom::che-1 DNA construct. Af en toe, dieren verliezen de rollende fenotype, die op een monddood maken duiden kan van de hsp-16.2prom::che-1 transgenic. Te goed onderhouden van de BAT28-stam, kies 10 roller dieren aan een nieuwe plaat en propageren selecteren voor het rollen van de dieren.
De toepassing van het protocol is beperkt tot de F1 RNAi-procedure, die betekent dat dieren waarvan de ouders (P0 generatie) niet zijn blootgesteld aan de lin-53 RNAi geslachtscellen naar neuron conversie als gevolg van maternale rescue4niet wordt weergegeven. Een alternatieve procedure germinale cellen te converteren naar neuronen is beschreven door Ciosk en collega’s15 met behulp van RNAi knock-down van gld-1 pt mex-3 zonder overmatige uitdrukking van een transcriptiefactor. Echter de verkregen neuronen niet behoren tot een bepaald type van neuronen en geslachtscellen ook omzetten in spier-achtige cellen op RNAi-gemedieerde uitputting van gld-1 pt mex-315. Eerder, is gebleken de RNAi tegen lin-53 toegestaan geslachtscellen omzetting in GABAergic neuron-achtige cellen bij overmatige expressie van het Pitx-type homoedomain transcriptiefactor UNC-3016 in plaats van CHE-14 . Voor toekomstige richtingen, kan verschillende lot-inducerende transcriptie factoren kunnen worden getest of lin-53 geslachtscellen uitgeput worden geconverteerd naar andere celtypes dan specifieke neuronen. In dit verband induceert overexpressie van de transcriptiefactor myogenic bHLH HLH-1, homolog van de zoogdieren MyoD17, conversie van geslachtscellen naar spieren bij lin-53 RNAi5. De gevestigde herprogrammering van geslachtscellen op een specifiek aantal somatische cellen type bij lin-53 RNAi en overmatige uitdrukking van een passende lot-inducerende transcriptiefactor kan worden gebruikt voor een aantal verschillende genetische schermen. Dergelijke schermen suppressor of versterker kunnen helpen ontrafeling van regelgevende trajecten die een rol tijdens de cel lot conversie spelen.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Alina El-Khalili en Martina Hajduskova voor technische bijstand. Wij danken de leden van de groep van de Tursun voor commentaar op het manuscript. Dit werk werd gesponsord door de ERC-StG-2014-637530 en ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922 en wordt ondersteund door de Max Delbrueck-Center for Molecular Medicine in de Helmholtz-vereniging.
Chemicals | |||
Agar-Agar, Kobe I | Roth | 5210.1 | |
Bactopeptone | A. Hartenstein GmbH | 211 677 | Peptone Media |
Yeast extract | AppliChem | A1552,0100 | |
Amphotericin B | USBiological | A2220 | |
CaCl2 | Merck Biosciences | 208290 | |
Cholesterol | Roth | 8866.2 | |
Gelatine | Roth | 4275.3 | |
IPTG | Sigma | 15502-10G | |
K2PO4 | Roth | T875.2 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
MgSO4 | VWR | 25,163,364 | |
Na2HPO4 | Roth | P030.1 | |
NaCl | Roth | 9265.1 | |
NaClO | Roth | 9062.3 | |
NaOH (5 N) | Roth | KK71.1 | |
Tris | Roth | AE15.2 | |
Carbenicillin | Roth | 634412 | |
Tetracycline | Roth | 2371.2 | |
Incubators | |||
Incubator | New Brunswick Scientific C24 | M1247-0052 | for heat-shock |
Incubator | Sanyo MIR-5 | 5534210 | for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C |
Microscopes | |||
Fluorescence microscope | M205 FA | Leica | |
Microscope (Imaging) + camera | Axio Imager 2 | Zeiss | |
Microscope (Imaging) + camera | Sensicam | PCO | |
Stereomicroscope | SMZ745 | Nikon | |
Bacterial strains | |||
Escherichia coli HT115 | F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse III minus). |
||
Escherichia coli OP50 | Uracil auxotroph E. coli strain | ||
Worm strains | |||
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V. |
derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2 | ||
RNAi Clones | |||
lin-53 | SourceBioscience | ID I-4D14 | Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12 |
empty vetor: L4440 | Addgene | #1654 | |
Misc. | |||
Worm pick | self-made using a pasteur pipette and a platinum wire |