Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için
Summary
Bu makalede, DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak malzeme son derece kalitesiz DNA’ın kurtarma dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol gösterilir.
Abstract
Herbaria biyolojik çalışmalar çeşitli kullanılan bitki materyali paha biçilmez bir kaynaktır. Sulak örnekler kullanımı zorlukları örnek koruma kalitesi, bozulmuş DNA ve nadir örneklerin yıkıcı örnekleme dahil olmak üzere, bir dizi ile ilişkilidir. Daha etkili bir şekilde sulak malzeme büyük sıralama projelerde kullanmak için güvenilir ve ölçeklenebilir yöntemi DNA izolasyon ve Kütüphane hazırlanması gereklidir. Bu kağıt bir sağlam, başına sonuna protokol değişikliği için bireysel örnekleri gerektirmeyen DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi Kütüphane yapımı için sulak örnekler üzerinden gösteriyor. Bu iletişim kuralı, Kütüphane boyutu seçimi değiştirme ve düşük verim kitaplıkları için bir isteğe bağlı reamplification adım tanıtımı doku kabuğu optimize ederek düşük kaliteli kurutulmuş bitki malzeme ve alır avantajı mevcut yöntemler için hazırlanmıştır. Reamplification düşük verim DNA kütüphanelerinin yeri doldurulamaz ve potansiyel olarak değerli sulak numuneler, ihtiyaç için ek yıkıcı örnekleme ve fark edilebilir sıralama önyargı için ortak tanıtımı olmadan inkâr türetilen örnekleri kurtarabilirsiniz Filogenetik uygulamaları. Protokol çim türleri yüzlerce üzerinde test edilmiştir, ancak doğrulama sonra diğer bitki soy kullanmak için adapte olması bekleniyor. Bu iletişim kuralı nerede parçaları istediğiniz boyuta aralığında var olmayan, son derece bozulmuş DNA ve temiz DNA izolasyon inhibe Sekonder metabolitler bazı bitki malzeme mevcut sınırlı olabilir. Genel olarak, bu protokol bırakmak için DNA izolasyon ve az 13 h, 24 örnekleri kitaplığı hazırlanması sadece 8 h minimal değişiklikler ile aktif uygulamalı zaman ile hızlı ve kapsamlı bir yöntem sağlar.
Introduction
Sulak koleksiyonları tür ve genomik çeşitlilik filogenetik1,2,3, Populasyon genetiği4,5, koruma çalışmaları için potansiyel olarak değerli bir kaynaktır Biyoloji6, istilacı türlerin Biyoloji7ve özellik evrim8. Zengin bir çeşitlilik türlerin, nüfus, coğrafi yer ve zaman puan elde etmek için yeteneğini sulak olduğunu “hazine sandığı”9 vurgulamaktadır. Tarihsel olarak, bozulmuş doğa sulak elde edilen DNA PCR tabanlı projeler genellikle yalnızca bölgeleri kloroplast genom veya ribozomal, iç kopya etmek Rondela (ITS) gibi yüksek bir kopyasını buldum işaretçileri kullanarak araştırmacılar relegating engel RNA. Örnekler ve DNA kalitesini kapsamlı koruma9,10, çift iplikçikli sonları ve parçalanma hasar en yaygın formları olmak, oluşturma kurutma işleminde kullanılan ısı ile yöntemleri göre değişir sözde % 90’ı DNA kilit-up bu çalışmalar PCR tabanlı11ipotekli. Parçalanma bir yana, ikinci en yaygın sulak genomik kirlenme, bu endophytic mantarlar13 türetilmiş veya mantar toplama sonra ama yine de içinde sulak12, montaj önce öldükten sonra edinilen gibi sorundur Bu sorun çözüldü bioinformatically şu mantar veritabanı (aşağıya bakın) verilen olabilir. Üçüncü ve daha az yaygın bir sorun ile sitozin Deaminasyon (C/G→T/A)14, sıra değişiklik olsa da sulak numuneler11‘ (~ %0,03) düşük olduğu tahmin edilmektedir. Yüksek işlem hacmi sıralama (HTS) gelişiyle, parçalanma sayısında kısa okuma ve düşük kalitesi ile çok sayıda numune üzerinden genomik düzeyinde veri toplama izin sıralama derinliği12,15, üstesinden gelebilir DNA ve hatta bazen tüm genom sıralama15erişimine izin verme.
Sulak örnekleri daha sık kullanılan olma ve filogenetik projeleri16büyük bir bileşenidir. HTS için sulak örnekler kullanarak geçerli bir meydan okuma tutarlı bir şekilde yeterli çift telli DNA, sıralama iletişim kuralları için gerekli bir ön koşul zamanında, çok sayıda tür yöntemleri birey için optimize etmek gerek kalmadan almaktır numuneler. Bu yazıda, bu mevcut yöntemlerden yararlanır ve onlara hızlı ve yinelenebilir sonuçları için izin vermek için değiştirir DNA ekstraksiyon ve Kütüphane sulak numunelerin hazırlanması için bir iletişim kuralı gösterilmiştir. Bu yöntem için tam 13 h, 8 h uygulamalı zamanla veya isteğe bağlı reamplification adım gerekli olduğunda 9 h uygulamalı zamanla 16 h 24 örnekleri kitaplığına örnek işleme sağlar. Daha fazla örnek aynı anda işleme ulaşılabilir, olsa da santrifüj kapasitesi ve teknik beceri sınırlayıcı faktördür. Protokol yalnızca tipik labaratuar donanımları (thermocycler, santrifüj ve manyetik duruyor) Nebulizatör veya sonicator, gibi özel ekipman yerine DNA kesme için gerektirecek şekilde tasarlanmıştır.
DNA kalite, parça boyutu ve miktar faktörler sulak örneklerin yüksek üretilen iş sıralama deneylerde kullanmak için sınırlı hale gelir. Sulak DNA izole ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplıkları oluşturmak için diğer yöntemleri 10 kadar az kullanma belgili tanımlık yarar göstermiştir ng DNA16; Ancak onlar deneysel olarak PCR optimum sayısını belirleme gerektiren bir kütüphane hazırlık için gerekli geçer. Son derece küçük miktarlarda uygun çift ile ilgili DNA (dsDNA), telli birkaç sulak numune yalnızca bir tek kitaplık hazırlık için yeterli DNA üretmek gibi bu pratik olur. DNA yok Kütüphane optimizasyonu adımda kayıp burada sunulan yöntem döngüleri örnek kalite, ne olursa olsun tek bir sayı kullanır. Bunun yerine, kitaplıkları sıralama için gerekli minimum tutarları uygun olmayan bir reamplification adım çağrılır. Birçok sulak örnekleri nadirdir ve sahip küçük malzeme birçok durumda yıkıcı örnekleme haklı zorlaştırır. Bu karşı sunulan Protokolü sağlar dsDNA giriş boyutları daha az 1,25 ng Kütüphane hazırlık sürecine yüksek üretilen iş sıralama ve örneklerin yıkıcı örnekleme gereksinimini en aza indirilmesi için uygun örnekleri kapsamını genişletiyor.
Aşağıdaki iletişim kuralı otlar için en iyi duruma getirilmiş ve protokol başka birçok bitki gruplarına uygulanabilir beklemek rağmen sulak örnekleri, farklı türlerin yüzlerce test. Düşük kaliteli ve/veya nadir örnekleri kaydetmek için kullanılan bir isteğe bağlı kurtarma adım içerir. Test iki yüz sulak numuneler üzerinde bağlı olarak, bu protokol bırakmak nadir örnekleri minimal yıkıcı örnekleme yoluyla korunması için numuneler ile düşük doku girdi ve kalite, çalışır. Burada bu protokolü phylogenomics tabanlı projeler için sıralı kaliteli kitaplıkları sağlayabilir gösterilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan Protokolü DNA izolasyon ve Kütüphane hazırlık kurutulmuş bitki örnekleri üzerinden sıralama için kapsamlı ve sağlam bir yöntemdir. Yöntemi ve bunu değiştirmek için çok az ihtiyaç örnek kalite make büyük sulak alan sıralama projeler için ölçeklenebilir temel. Düşük verim kitaplıkları için bir isteğe bağlı reamplification adım dahil düşük kaliteli, düşük miktar, nadir, ya da başka türlü sıralama için uygun olmaz tarihsel açıdan önemli örnekleri dahil sağlar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Taylor AuBuchon-yaşlı, Jordan Teisher ve Kristina Zudock için örnekleme sulak numuneler yardım ve Missouri Botanical Garden erişim sulak numuneler için yıkıcı örnekleme için teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal Bilim Vakfı (DEB-1457748) bir hibe destek oldu.
Materials
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4452300 | 96 well |
| Gel Imaging System | Azure Biosystems | c300 | |
| Microfuge 20 Series | Beckman Coulter | B30137 | |
| Digital Dry Bath | Benchmark Scientific | BSH1001 | |
| Electrophoresis System | EasyCast | B2 | |
| PURELAB flex 2 (Ultra pure water) | ELGA | 89204-092 | |
| DNA LoBind Tube | Eppendorf | 30108078 | 2 ml |
| Mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Mortar | Fisher Scientific | S02591 | porcelain |
| Pestle | fisher Scientific | S02595 | porcelain |
| Centrifuge tubes | fisher Scientific | 21-403-161 | |
| Microwave | Kenmore | 405.7309231 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| 0.2 ml Strip tube and Cap for PCR | VWR | 20170-004 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Balance | Mettler Toledo | PM2000 | |
| Liquid Nitrogen Short-term Storage | Nalgene | F9401 | |
| Magnetic-Ring Stand | ThermoFisher Scientific | AM10050 | 96 well |
| Water Bath | VWR | 89032-210 | |
| Hot Plate Stirrers | VWR | 97042-754 | |
| Liquid Nitrogen | Airgas | UN1977 | |
| 1 X TE Buffer | Ambion | AM9849 | pH 8.0 |
| CTAB | AMRESCO | 0833-500G | |
| 2-MERCAPTOETHANOL | AMRESCO | 0482-200ML | |
| Ribonuclease A | AMRESCO | E866-5ML | 10 mg/ml solution |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63882 | |
| Sodium Chloride | bio WORLD | 705744 | |
| Isopropyl Alcohol | bio WORLD | 40970004-1 | |
| Nuclease Free water | bio WORLD | 42300012-2 | |
| Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | A393-500 | |
| Sodium Acetate Trihydrate | Fisher Scientific | s608-500 | |
| LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| 100bp PLUS DNA Ladder | Gold Biotechnology | D003-500 | |
| EDTA, Disodium Salt | IBI Scientific | IB70182 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| TRIS | MP Biomedicals | 103133 | ultra pure |
| Gel Loading Dye Purple (6 X) | New England BioLabs | B7024S | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England BioLabs | M0348L | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7645L | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | New England BioLabs | E7600S | Dual Index Primers Set 1 |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543L | |
| Mag-Bind RXNPure Plus | Omega bio-tek | M1386-02 | |
| GelRed 10000 X | Pheonix Research | 41003-1 | |
| Phenol solution | SIGMA Life Science | P4557-400ml | |
| PVP40 | SIGMA-Aldrich | PVP40-50G | |
| Chloroform | VWR | EM8.22265.2500 | |
| Ethanol | Koptec | V1016 | 200 Proof |
| Silica sand | VWR | 14808-60-7 | |
| Reamplification primers | Integrated DNA Technologies | see text | |
| Sequencher v.5.0.1 | GeneCodes | ||
Referências
- Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement. Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).
- Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico. Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).
- Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn. Ann Bot. , (2017).
- Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris. Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).
- Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. Back to the future: museum specimens in population genetics. Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).
- Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. How many herbarium specimens are needed to detect threatened species?. Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).
- Saltonstall, K. Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America. PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).
- Besnard, G., et al. From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition. J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).
- Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS ONE. 7 (8), e43808 (2012).
- Harris, S. A. DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods. Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).
- Staats, M., et al. DNA damage in plant herbarium tissue. PLoS ONE. 6 (12), e28448 (2011).
- Bakker, F. T., et al. Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline. Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).
- Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA. Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).
- Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA. Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).
- Staats, M., et al. Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens. PLoS ONE. 8 (7), e69189 (2013).
- Bakker, F. T. Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens. Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide. Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).
- Twyford, A. D., Ness, R. D. Strategies for complete plastid genome seqeuncing. Mol Eco Resour. , (2016).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Bio. 12 (2), R18 (2011).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).
- Grigoriev, I. V., et al. MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes. Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).
- Herbarium Genomics. Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- . Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae). Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).
- McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes. Bioinf. , (2016).
- Staton, S. E., Burke, J. M. Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads. Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).
- Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mobile DNA. 6 (1), 11 (2015).
- . Transposons Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- Weiß, C. L., et al. Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens. Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239 (2016).
- Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA. PLoS ONE. 7 (3), e34131 (2012).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
- Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis. Am J Bot. 99, 312-319 (2012).
