강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

표 본관 컬렉션은 종 및 계통학^1,2,3, 인구 유전학^4,5, 보존을 포함 하 여 연구에 대 한 게놈 다양성의 잠재적으로 귀중 한 소스 생물학⁶, 침략 적인 종의 생물학⁷, 그리고 특성 진화⁸. 다양 한 종, 인구, 지리적 위치, 및 시간 포인트를 얻을 수 있는 식물 표본 상자 “보물 상자”⁹ 를 강조 표시 합니다. 역사적으로, 표 본관 파생 DNA의 저하 자연 PCR 기반 프로젝트, 종종 높은 복사, 엽록체 게놈 또는 ribosomal의 내부 베낀된 스페이서 (ITS)의 지역 등에 마커를 사용 하 여 연구자를 일하고 방해 했다 RNA입니다. 표본 및 DNA의 품질 보존^9,10, 더블-좌초 나누기와 손상의 가장 흔한 형태 되 고, 건조 과정에서 사용 되는 열에서 조각화의 방법에 광범위 하 게 따라 다는 소위 90 %DNA 잠금 업 된 PCR 기반 연구¹¹지 장 있다. 조각화, 외 표 본관 유전체학에서 두 번째로 가장 널리 퍼진 문제는 오염, 그¹³ endophytic 균 류 파생 된 또는 수집 후 하지만 그래도 표 본관¹²에 장착 하기 전에 곰 팡이 사후 인수 이 문제 해결된 bioinformatically 바로 곰 팡이 데이터베이스 (아래 참조) 제공 될 수 있습니다. 세 번째, 및 보다 적게 일반적인 문제는 비록 표 본관 표본¹¹(~ 0.03%) 낮은 것으로 추정 된다 시 토 신 탈 (C/G→T/A)¹⁴, 통해 시퀀스 수정 이다. 높은 처리량 시퀀싱 (HTS)의 출현, 조각의 문제는 짧은 읽기 및 시퀀싱 깊이^12,15, 낮은 질을 가진 수많은 표본에서 게놈 수준의 데이터 수집을 허용으로 극복할 수 있습니다. DNA, 그리고 때로는 심지어 전체 게놈 시퀀싱¹⁵허용.

식물 표본 상자 견본 더 자주 사용 되 고 있으며 계통 발생 프로젝트¹⁶의 큰 구성 요소. HTS에 대 한 식물 표본 상자 견본을 사용 하 여 현재 도전 개인에 대 한 메서드를 최적화 하지 않고도 충분 한 더블 좌초 DNA 시퀀싱 프로토콜에 대 한 필요한 필수 적절 한 시기에 수많은 종에서 얻는 지속적으로 표본입니다. 이 논문에서는, DNA 추출 및 표 본관 표본 라이브러리 준비에 대 한 프로토콜을 기존의 방법의 활용 및 결과 신속 하 고 복제할 수 있도록 그들을 수정 시연입니다. 이 방법은 완전 한 13 h 8 h 실습 시간, 또는 9 h 실습 시간 때 옵션 reamplification 단계는 필요와 함께 16 h 24 샘플 라이브러리에 견본에서 처리 수 있습니다. 더 많은 샘플의 동시 처리는 달성, 비록 제한 요소는 원심 분리기 용량 및 기술. 프로토콜은 DNA를 전단에 대 한만 전형적인 실험실 장비 (thermocycler, 원심 분리기, 마그네틱 스탠드) 대신 분무기 또는 sonicator, 특수 장비를 요구 하도록 설계 되었습니다.

DNA 품질, 조각 크기 및 수량 표 본관 표본 높은 처리량 시퀀싱 실험에서의 사용에 대 한 요인 제한. 식물 표본 상자 DNA를 분리 하 고 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리를 만들기 위한 다른 방법을 10 만큼 약간을 사용 하 여 유틸리티를 증명 하고있다 ng의 DNA¹⁶; 그러나 라이브러리 준비에 필요한 사이클 그들은 실험적으로 PCR의 최적 수를 결정 해야 합니다. 이것은 된다 허무 다루는 상당히 적은 양의 가능한 더블 좌초 DNA (dsDNA) 때 일부 표 본관 표본 단일 라이브러리 준비에 대 한 충분 한 DNA를 생산. 여기에 제시 된 방법 아무 DNA 라이브러리 최적화 단계에서 분실 된다 그래서 샘플 품질에 사이클의 단일 번호를 사용 합니다. 대신, reamplification 단계 라이브러리 시퀀싱에 필요한 최소 금액을 충족 하지 않는 경우 호출 됩니다. 많은 식물 표본 상자 견본 드물다 고 많은 경우에 파괴적인 샘플링을 정당화 하기 어려운 작은 재료를가지고. 이 카운터, 제시 프로토콜 허용 dsDNA 입력 크기 미만 1.25 ng 도서관 준비 과정, 높은 처리량 시퀀싱 및 표본의 파괴적인 샘플링에 대 한 필요를 최소화에 대 한 실행 가능한 샘플의 범위를 확대.

다음 프로토콜 잔디에 최적화 되었고 비록 우리가 기대 하는 다른 많은 식물 그룹에 프로토콜을 적용할 수 있는 식물 표본 상자 견본에서 다른 종의 수백에 테스트. 그것은 낮은 품질 및 희귀 표본 저장 하는 데 사용할 수 있는 선택적 복구 단계를 포함 합니다. 이상 2 백 표 본관 표본 테스트에 따라,이 프로토콜 표본 낮은 조직 입력 및 품질, 최소한의 파괴적인 샘플링을 통해 희귀 한 표본의 보존에 대 한 허용에 작동 합니다. 여기이 프로토콜 phylogenomics 기반 프로젝트에 대 한 시퀀싱 할 수 있는 높은 품질 라이브러리를 제공할 수 있습니다 표시 됩니다.