植物标本标本的鲁棒 DNA 分离与高通量测序库建设

植物标本集是一个潜在的有价值的物种和基因组多样性的来源的研究, 包括系统学 1, 2, 3, 人口遗传学 4, 5, 保护生物⁶, 入侵物种生物⁷和特征演变⁸。获得丰富多样的物种、种群、地理位置和时间点的能力突出了 “宝箱”⁹ , 即标本馆。从历史上看, 植物标本所衍生的 DNA 退化的性质阻碍了 PCR 的项目, 往往贬低研究人员只使用高拷贝中发现的标记, 如叶绿体基因组的区域或核糖体的内部转录间隔 (其)rna.标本和 DNA 的质量因保存^9、10的方法而有很大的差异, 在干燥过程中使用的热的双绞碎和破碎是最常见的损害形式, 造成所谓的 90% DNA 锁定, 已使基于 PCR 的研究¹¹。除了碎片, 植物标本组学的第二个最普遍的问题是污染, 例如从内生真菌中提取的¹³或真菌在收集后死后被采集, 但在标本室中安装¹²之前, 虽然这个问题可以解决 bioinformatically 给出正确的真菌数据库 (见下文)。第三个和更不常见的问题是通过胞嘧啶脱氨作用 (C/G→T/A⁾14 进行序列修改, 虽然估计在标本^标本11 中的低 (~ 0.03%)。随着高通量测序 (高温超导) 的出现, 碎片问题可以通过短读取和排序深度^12,15来克服, 从而允许从许多质量较低的样本中获取基因组级数据。DNA, 甚至有时允许整个基因组排序¹⁵。

标本室标本越来越多地被使用, 是系统发育项目的一个更大的组成部分¹⁶。目前的挑战是使用植物标本标本为高温超导始终获得足够的双链 DNA, 一个必要的先决条件, 排序协议, 从众多物种及时, 不需要优化的方法, 个别标本.本文介绍了一种利用现有方法进行 DNA 提取和库标本制备的协议, 并对其进行修改, 以实现快速、可复制的结果。该方法允许从标本到24个样本库的完整处理, 在13小时, 具有8小时的动手时间, 或 16 h, 与 9 h 的实际操作时间, 当需要可选的 reamplification 步骤。同时处理更多的样品是可以实现的, 虽然限制因素是离心能力和技术技能。该协议的目的是只需要典型的实验室设备 (thermocycler, 离心机和磁性支架), 而不是专门的设备, 如喷雾器或 sonicator, 为剪切 DNA。

在高通量测序实验中, DNA 质量、片段大小和数量是限制标本标本使用的因素。其他隔离标本室 dna 和创建高通量测序库的方法表明, 使用10的 DNA¹⁶的效用不大;然而, 它们需要实验性地确定图书馆准备所需的最佳 PCR 周期数。当处理极少量可行的双链 DNA (dsDNA) 时, 这种方法变得不切实际, 因为有些标本标本只为单个库的制备提供了足够的 dna。这里提出的方法使用单一数量的周期, 不管样本质量如何, 所以在库优化步骤中没有丢失 DNA。相反, 当库不满足排序所需的最小金额时, 将调用 reamplification 步骤。许多植物标本是罕见的, 并拥有很少的材料, 使得难以证明破坏性抽样在许多情况下。为了对付这一问题, 所提出的协议允许 dsDNA 的输入大小小于1.25 到库的准备过程, 扩大了可行样本的范围, 以高通量测序, 并尽量减少对样本的破坏性抽样的需要。

下面的协议已经为牧草进行了优化, 并在标本室标本上对数以百计的不同物种进行了测试, 尽管我们预计该协议可以应用于许多其他植物群。它包括一个可选的恢复步骤, 可用于保存低质量和/或稀有标本。根据200余种标本标本, 本协议适用于组织投入和质量低的标本, 可通过最小的破坏性抽样保存稀有标本。这里表明, 该协议可以提供高质量的库, 可以为基于 phylogenomics 的项目排序。