Sviluppo di un test In Vitro per quantificare progenitrici e staminali ematopoietiche cellule (HSPCs) nello sviluppo di embrioni di Zebrafish
Summary
Qui, presentiamo un metodo semplice per quantificare le cellule ematopoietiche staminali e progenitrici (HSPCs) in zebrafish embrionale. HSPCs dallo zebrafish dissociate sono placcati in metilcellulosa con fattori solidale, differenziando in sangue maturo. Questo consente il rilevamento di sangue difetti e permette lo screening per essere facilmente condotto.
Abstract
L’ematopoiesi è un processo cellulare essenziale in cui cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPCs) si differenziano nella moltitudine degli stirpi differenti delle cellule che compongono il sangue maturo. Isolamento ed identificazione di questi HSPCs è difficile perché sono definiti ex post facto; possono essere definiti solo dopo la loro differenziazione in cellule specifiche. Negli ultimi decenni, il pesce zebra (Danio rerio) è diventato un organismo modello per studiare l’ematopoiesi. Embrioni di zebrafish sviluppano ex uteroe di post-fertilizzazione 48h (hpf) hanno generato definitiva HSPCs. saggi per valutare la differenziazione HSPC e sono state sviluppate capacità di proliferazione, che utilizza il trapianto e successive ricostituzione del sistema ematopoietico oltre a visualizzare linee specializzate transgenici con microscopia confocale. Tuttavia, queste analisi sono costo proibitivo, tecnicamente difficile e richiede tempo per molti laboratori. Sviluppo di un modello in vitro per valutare HSPCs sarebbe conveniente, più veloce, e presenti meno difficoltà rispetto al precedentemente descritti metodi, che permettano di laboratori valutare rapidamente le schermate di mutagenesi e droga che influiscono sulla biologia HSPC. Questo romanzo in vitro test per valutare la HSPCs viene eseguito da embrioni di zebrafish intero placcatura dissociata e aggiungendo fattori esogeni che promuovono solo HSPC differenziazione e la proliferazione. Gli embrioni sono dissociati in cellule singole e placcati con HSPC-solidale Colonia di granulociti che causano loro di generare unità formanti colonie (CFU) che derivano da una cellula progenitrice singolo. Queste analisi dovrebbero consentire un esame più attento delle vie molecolari responsabili della proliferazione, la differenziazione e il regolamento, che permetterà ai ricercatori di capire le basi della ematopoiesi vertebrato e sua disregolazione HSPC durante la malattia.
Introduction
L’ematopoiesi è il processo di fare il gran numero di cellule ematiche mature, necessaria per la sopravvivenza di un organismo. È un processo chiave di sviluppo che coinvolge la differenziazione di cellule staminali ematopoietiche (HSCs) in una varietà di tipi cellulari inerente allo sviluppo limitato che comprendono sangue maturo. Questi HSCs devono rinnovarsi affinché il sistema non è mai esaurito e si deve mantenere dal primo sviluppo embrionale fino alla morte. Nei vertebrati, costante differenziazione e la proliferazione delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPCs) sono necessari per alimentare adeguatamente la maggior parte delle cellule del sangue che sono post-mitotici e viene riciclato ogni giorno. HSC generano cellule ematiche mature differenziando prima in sottoinsiemi di cellule progenitrici limitato; comuni progenitori linfoidi (CLPs)1, che alla fine producono le cellule T, B e NK e comuni dei progenitori mieloidi (CMPs)2 che generano i granulociti, eritrociti, macrofagi e megacariociti. Questi progenitori si sono impegnati a generare cellule specifiche e ulteriormente differenziano in altre cellule progenitrici inerente allo sviluppo limitato come progenitori eritroidi mieloide (MEP) che generano gli eritrociti e piastrine o granulociti progenitori del macrofago (GMP) che generano i basofili, eosinofili, neutrofili e macrofagi2. Identificare e isolare questi progenitori permette l’identificazione di importanti vie molecolari coinvolti nel differenziamento ematopoietico e molte malattie ematopoietiche come leucemia sorgono quando queste cellule progenitrici non correttamente differenziare.
Negli ultimi decenni, il sistema di modello di zebrafish (Danio rerio) è diventato uno strumento chiave della ricerca per gli studi emopoietici embrionali ed adulti. Zebrafish sono suscettibile di analisi genetica e le specie di vertebrati modello filogeneticamente più basse che hanno un simile sistema vascolare e sistema ematopoietico agli esseri umani. Embrioni di zebrafish sviluppano ex utero, ed entro 48 ore post fertilizzazione (hpf) generare HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebrafish sono altamente fertile, anche con le femmine posa oltre 100 uova in un singolo frizione, permettendo per campioni di grandi dimensioni e replica sperimentale. Embrioni di zebrafish sono otticamente trasparenti, consentendo per visualizzazione microscopica del sistema ematopoietico. Parecchie linee transgeniche fluorescente di zebrafish marcatura HSCs come runx1: EGFP pesce9, cd41: EGFP pesce10, e kdrl:mCherry; cMyb: animali GFP3 double-positivo, consentire per la visualizzazione in tempo reale di HSC emersione ed espansione in vivo3,4,7,8, 9. Generazione veloce tempo e sviluppo ex utero di zebrafish ha condotto al relativo uso in droga e mutagenesi studi11,12,13,14,15 16,17,18,19,20 per composti che contengono promessa terapeutica per malattie del sangue umano di screening. Nel complesso, conservazione del sistema ematopoietico, la presenza e il facile sviluppo di linee transgeniche e il tempo di rigenerazione rapida ha reso zebrafish un modello economico, veloce, flessibile e ideale per studi ematopoietici.
Sono stati sviluppati numerosi metodi di isolamento e test HSCs nei sistemi mammiferi ematopoietici. Gli investigatori possono utilizzare una combinazione di recettori di superficie per Marco HSCs21,22,23,24, nonché di sfruttare la capacità di HSCs di efflusso tintura25,26. Dopo sono etichettati, fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) consente loro separazione fisica. Dimostrare che una cella è un HSC richiede irradiando un animale ospite per distruggere HSPCs endogena, trapianto di HSC putativo e osservando la ricostituzione a lungo termine, multi-lignaggio di tutto maturo tipi di cellule del sangue. Questi test funzionano bene in topi, come ci sono numerosi cellula-superficie anticorpi contro le cellule ematopoietiche e ceppi inbred del mouse che facilitano immuni per il trapianto. Tuttavia, pochi anticorpi di superficie delle cellule ematopoietiche zebrafish sono stati generati27, ostacolando l’identificazione e l’isolamento di HSCs. Il modo più comune per contrassegnare e isolare HSCs zebrafish è con animali transgenici, per cui una sequenza di cellula-specifico promotore sta guidando la espressione di una proteina fluorescente. Studi hanno visualizzato ed enumerato HSCs nella parete ventrale dell’aorta dorsale con microscopia che utilizzano questa tecnica3,4,8,9. Altri laboratori hanno generato ceppi clonali di zebrafish28,29 e sono effettuati trapianti di successo negli animali MHC-abbinato30. Tuttavia, queste tecniche sono costi proibitivi per molti laboratori, sono tecnicamente difficili e richiedono molto tempo. Per risolvere questi problemi, laboratori hanno generato diversi saggi in vitro per verificare la presenza, i tassi di proliferazione e la capacità di differenziazione di HSPCs31,32,33, 34,35,36. Queste analisi mostrano la proliferazione e la differenziazione di HSPCs in vitro31,32,33,34,35,36, il salvataggio di ematopoietiche difetti36e un metodo efficiente per l’individuazione e sperimentazione di citochine33,34,35. Essi sono stati utilizzati anche per identificare i geni responsabili HSPC biologia31,32. In questo studio, prendiamo queste analisi un passo avanti, consentendo la quantificazione di HSPCs in un embrione di zebrafish sviluppo. Queste analisi possono essere utilizzate anche per quantificare il numero di HSPCs in animali mutanti e gli animali trattati con farmaci emopoietici dirompente. In sostanza, queste analisi sono veloce, presenti alcune sfide tecniche e sono modi economici per quantificare i numeri HSPC, esaminare la loro proliferazione e indagare blocchi nella differenziazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema di modello di zebrafish è diventato un modello efficiente, efficace ed economico per studiare l’ematopoiesi vertebrato primitivo e definitiva. Generazione di saggi che sono veloci, poco costoso e presenta alcune difficoltà tecniche può essere utilizzato per test di piccole molecole, analizzando gli embrioni mutanti e delucidare i meccanismi molecolari importanti per la biologia HSPC. Placcatura in vitro di HSPCs dallo zebrafish adulto è un metodo efficace per studiare la mutagenesi e citochine ema…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanziamento è stato fornito dal National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1 a D.L.S.), il California State University Program per formazione & ricerca in biotecnologia (CSUPERB: controllo molecolare della nicchia emopoietica vertebrati a D.L.S.) e dall’ufficio studi universitari presso la California State University di Chico (a A.C.B.).
Materials
| 10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
| DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
| Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
| Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
| 10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| 15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
| AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
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