Mediante ibridazione In Situ di fluorescenza (pesce) per monitorare lo stato di coesione braccio in prometafase e metafase I Oocytes di Drosophila
Summary
Questo manoscritto presenta un metodo dettagliato per la generazione di X-cromosoma braccio sonde e performanti in situ ibridazione di fluorescenza (pesce) per esaminare lo stato della sorella coesione cromatidio in prometafase e metafase sono arrestato Drosofila ovociti. Questo protocollo è adatto a determinare se la coesione meiotica braccio è intatto o perturbato in differenti genotipi.
Abstract
Negli esseri umani, gli errori di segregazione del cromosoma in ovociti sono responsabili della maggior parte di aborti e malformazioni congenite. Inoltre, come le donne invecchiano, il loro rischio di concepire che un feto aneuploide aumenta notevolmente e questo fenomeno è noto come l’effetto dell’età materna. È un requisito per la segregazione del cromosoma accurata durante le divisioni meiotiche manutenzione della sorella coesione tra cromatidi fratelli durante il periodo di profase estesa esperienza di ovociti. Prova citologica in entrambi esseri umani e gli organismi modello suggerisce che coesione meiotica si deteriora durante il processo di invecchiamento. Inoltre, gli errori di segregazione in ovociti umani sono più prevalenti durante la meiosi I, coerente con la perdita prematura di coesione di braccio. L’uso di organismi modello è fondamentale per dipanare i meccanismi che sottendono la perdita età-dipendente di coesione. Drosophila melanogaster offre diversi vantaggi per studiare il regolamento di meiotic coesione negli ovociti. Tuttavia, fino a poco tempo, solo i test genetici erano disponibili test per la perdita di coesione del braccio in ovociti di genotipi diversi o in diverse condizioni sperimentali. Qui, un protocollo dettagliato è fornito per l’utilizzo di fluorescenza in situ ibridazione (pesce) per visualizzare direttamente difetti nella coesione del braccio in prometafase io e metafase sono arrestato ovociti di Drosophila . Generando una sonda di pesce che ibridizza con il braccio distale del cromosoma X e raccogliendo gli stack Z confocale, un ricercatore può visualizzare il numero di singoli segnali di pesce in tre dimensioni e determinare se sorella cromatidio braccia sono separati. La procedura descritta permette di quantificare i difetti di coesione braccio in centinaia di Drosophila ovociti. Come tale, questo metodo fornisce un importante strumento per indagare i meccanismi che contribuiscono alla coesione manutenzione, nonché i fattori che portano alla sua scomparsa durante il processo di invecchiamento.
Introduction
Corretta segregazione dei cromosomi durante la mitosi e meiosi richiede che la sorella cromatidio coesione essere stabilito, mantenuto e rilasciato in un modo coordinato1,2. Coesione è stabilito durante la fase S ed è mediato dalla coesina complessa, che forma legami fisici che tengono la sorella cromatidi insieme. Nella meiosi, coesione distale di un crossover funziona anche per tenere insieme gli omologhi ricombinanti e questa associazione fisica contribuisce a garantire il corretto orientamento di bivalente su metafase mandrino (Figura 1)3,4, 5. Rilascio del braccio coesione a anafase permette l’omologhi segregare ai poli opposti del mandrino. Tuttavia, se la coesione del braccio è perso prematuramente, ricombinanti omologhi perderanno loro connessione fisica e segregare in modo casuale, che può provocare gameti aneuploid (Figura 1).
In ovociti umani, errori nella segregazione del cromosoma sono la principale causa di aborti e malformazioni alla nascita, come la sindrome di Down6, e la loro incidenza aumenta esponenzialmente con l’età materna7. Coesione di cromatidio della sorella è stabilito negli ovociti fetali e ricombinazione meiotic viene completata prima della nascita. Ovociti quindi arrestare in Mid-Profase I fino a quando l’ovulazione e durante questo periodo di arresto, l’associazione fisica costante degli omologhi ricombinanti si basa sulla sorella coesione tra cromatidi fratelli. Di conseguenza, accurata segregazione durante la meiosi e gli esiti di gravidanza normale richiedono che coesione rimangono intatti per fino a cinque decenni.
La perdita prematura di coesione durante l’arresto prolungato meiotic di ovociti umani è stata proposta per contribuire all’effetto dell’età materna e linee multiple di prova supportano questa ipotesi8,9. Tuttavia, date le sfide di studiare meiotica coesione in ovociti umani, gran parte della nostra comprensione di questo fenomeno si basa sull’uso di modello organismi5,10,11,12, 13,14,15.
Drosophila melanogaster ovociti offrono numerosi vantaggi per lo studio della coesione e cromosoma meiotic di segregazione. Una semplice analisi genetica permette di recuperare la progenie da gameti aneuploid e misurare la fedeltà di X-segregazione cromosomica su una larga scala11,16,17. Inoltre, si può anche determinare se gli errori di segregazione del cromosoma sorgono perché missegregate ricombinanti omologhi durante la meiosi I, un fenotipo che è coerenza con la perdita prematura di braccio coesione11,18, 19. diretta osservazione dello stato di coesione meiotica in ovociti di Drosophila è anche possibile mediante ibridazione in situ di fluorescenza (pesce). Anche se oligonucleotidi fluorescenti che ibridano a sequenze ripetitive satellite sono stati utilizzati per oltre un decennio per monitorare pericentromeric coesione maturo Drosophila ovociti4,20, analisi del braccio coesione è stato molto più difficile. Visualizzazione dello stato di coesione braccio richiede una sonda che si estende su una vasta regione di copia singola sequenze ed è abbastanza luminosa per provocare segnali visibili per singolo sorella cromatidi quando braccio coesione è assente. Inoltre, il condizioni di fissazione degli ovociti e le dimensioni delle autorità nazionali designate con etichettate deve facilitare la penetrazione21 nell’ovocita maturo grande di Drosophila (200 µm larga di 500 µm lungo). Recentemente, una sonda di braccio è stato correttamente utilizzato per prevedere i cromatidi oocita di Drosophila durante l’anafase io, ma gli autori ha dichiarato che potrebbe non rilevare un segnale in prometafase o metafase sono arrestato ovociti22. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la generazione di X-braccio del cromosoma FISH sonde e le condizioni di preparazione degli ovociti che ci hanno permesso di analizzare per la perdita prematura della sorella coesione cromatidio in prometafase io e metafase ho ovociti. Queste tecniche, che hanno permesso di identificare prodotti genici che sono necessari per il mantenimento della coesione meiotica, permetterà ad altri di dosaggio per sorella coesione cromatidio difetti in ovociti maturi di Drosophila di genotipi differenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’uso di pesce sonde per valutare lo stato di coesione braccio in prometafase io e metafase ho Drosophila ovociti è un progresso significativo nel campo della drosofila meiosi. Storicamente, i ricercatori della Drosophila sono stati limitati a test genetici per dedurre la perdita prematura di coesione braccio in ovociti maturi11,18,19. Ora, con i metodi qui presentati, lo stato di coesione del braccio…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIH Grant GM59354 assegnato a Sharon E. Bickel. Ringraziamo Huy d. Nguyen per assistenza nello sviluppo del protocollo per la generazione di sonde fluorescenti braccio, Ann Lavanway per aiuto con microscopia confocale e J. Emiliano Reed per l’assistenza tecnica. Ringraziamo anche numerosi colleghi nella comunità della drosofila per utili discussioni e consigli.
Materials
| Kits | |||
| Midi Prep kit | Qiagen | 12143 | Prep BAC clone DNA |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2 | Amplify BAC clone DNA |
| ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit | Invitrogen | A21676 | Label BAC clone DNA |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals & Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Freeze aliquots |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C75-500 | |
| DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use. |
| Dextran sulfate | Sigma | D-8906 | |
| Drierite | Drierite Company | 23001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 15508-013 | Prepare 10 mM stock |
| dTTP (10 µmol, 100 µl) | Boehringer Mannheim | 1277049 | Prepare 1 mM stock |
| EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) | Fisher Scientific | S311-500 | Prepare 250 mM stock |
| 100% ethanol (molecular grade, 200 proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Tris (Ultra Pure) | Invitrogen | 15504-020 | |
| EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) | Sigma | E-3889 | |
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | Toxic: wear appropriate protection |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | Toxic: wear appropriate protection |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Glycogen | Roche | 901393 | |
| HEPES | Boehringer Mannheim | 737-151 | |
| Heptane | Fisher Scientific | H350-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydrochloric acid | Millipore | HX0603-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydroxylamine | Sigma | 438227 | Prepare 3 M stock |
| 4.9 M Magnesium chloride | Sigma | 104-20 | |
| Na2HPO4 Ÿ 7H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaH2PO4 Ÿ 2H2O | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Poly-L-lysine (0.1mg/ml) | Sigma | P8920-100 | |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
| Sodium acetate | Fisher Scientific | S209-500 | Prepare 3M stock |
| Sodium cacodylate | Polysciences, Inc. | 1131 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Sodium chloride |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| 10% Tween 20 | Thermo Scientific | 28320 | Surfact-Amps |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0 | ||
| 20X SSC (Saline Sodium Citrate) | 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate | ||
| 2X cacodylate fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA | ||
| 1.1X Hybridization buffer | 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate | ||
| Fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution | ||
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| PBSTx | 1X PBS, 1% Trition X-100 | ||
| Extraction buffer (PBSTx + Rnase) | 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase | ||
| 2X SSCT | 2X SSC, 0.1% Tween 20 | ||
| 2X SSCT + 20% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide | ||
| 2X SSCT + 40% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide | ||
| 2X SSCT + 50% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| AluI | New England Biolabs | R0137S | |
| HaeIII | New England Biolabs | R0108S | |
| MseI | New England Biolabs | R0525S | |
| MspI | New England Biolabs | R0106S | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167S | |
| BfuCI | New England Biolabs | R0636S | |
| 100X BSA | New England Biolabs | Comes with NEB enzymes | |
| 10X NEB buffer #2 | New England Biolabs | Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes | |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl | Roche/Sigma | 3333566001 | |
| TdT buffer | Roche/Sigma | Comes with TdT enzyme | |
| Cobalt chloride | Roche/Sigma | Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme | |
| RNase A (10 mg/mL) | Thermo-Scientific | EN0531 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytology Tools etc. | |||
| Forceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9” Disposable glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | Autoclave to sterilize |
| Shallow glass dissecting dish | Custom made | ||
| Deep well dish (3 wells) | Pyrex | 7223-34 | |
| Fisherfinest Premium microscope slides | Fisher Scientific | 22-038-104 | Used to cover deep well dishes |
| Frosted glass slides, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick | Thermo-Scientific | 3051 | |
| Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 | Thermo-Scientific | 3405 | |
| Tungsten needle | homemade | ||
| Prolong GOLD mounting media | Molecular Probes | P36930 | |
| Compressed-air in can | Various | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Various | ||
| Nanodrop 2000, spectrophotometer | Thermo-Scientific | microvolume spectrophotometer | |
| Vortexer | Various | ||
| Table top microfuge at room temperature | Various | ||
| Table top microfuge at 4 °C | Various | ||
| Heat block | Various | ||
| Hybridization oven or incubator with rotator | Various | ||
| Nutator | Various | ||
| A1RSi laser scanning confoal | Nikon | 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables etc. | |||
| 50 mL conical tubes | Various | ||
| 15 mL conical tubes | Various | ||
| 1.5 mL microfuge tubes | Various | ||
| 500 µl microfuge tubes | Various | ||
| 200 µl PCR tubes | Various | ||
| Plastic container with tight fitting lid | Various | To hold Drierite | |
| Kimwipes | Various | disposable wipes | |
| Parafilm | Various | paraffin film | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Outro | |||
| HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | Version 6.3 |
Referências
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