Effekterna av organiska klorbekämpningsmedel (OCPs) på hälsan, t ex reproduktionsstörningar, immunologisk toxicitet, metaboliska förändringar har tidigare studerats^1,2,3. Metoderna för att upptäcka cellulär metabolism och ta reda på mitokondriell dysfunktion har gjort det möjligt för forskare att förstå rollen av mitokondriell funktion (dvs., mitokondriellt STAT3 nivåer, laktat, pyruvat, laktat-till-pyruvat förhållande, coenzym Q10, mitokondriell protonläcka, bioenergika, biogenes, och dynamik) inom områden som åldrande, fetma, diabetes, kardiovaskulär funktion, cancer, och säkerhet toxicitet^4,5,6,7. I detta dokument beskriver vi metoderna på att bedöma mitokondriell dysfunktion orsakas av OCPs.

Vi exponerade HepG2-celler för β-hexaklorokyclohexane (β- HCH), en representativ OCPs, för 24 h vid en dos som motsvarar intern exponering av människa. För det första tillämpades TEM för att observera den ultrastruktur av hepatocyter, såsom kärnor, mitokondrier och endoplasmatisk reticulum⁸. Jämfört med vanliga mikroskop, TEM gör det möjligt att utforska 2D och 3D ultra-struktur av celler och cellkomponenter (cellinjer eller vävnad), morfologi, kemisk sammansättning, samt funktion av naturliga eller konstgjorda material som spelar en central roll i modern vetenskap och teknik. Mitokondriell funktion utvärderades ytterligare av mitokondriell fluorescensintensitet, adenosin 5′-triphosphate (ATP) nivåer, syreförbrukningshastighet (OCR) och mitokondriell membranpotential (MMP)i HepG2-celler inkuberade med β-HCH. Mito-tracker grön är en mitokondrierna grön fluorescerande sond som kan användas för levande cell mitokondriell-specifika fluorescerande färgning. Mitokondrierna i hepatocyter var färgas av mito-tracker grön lösning och mitokondriell fluorescens intensitet, antal och mönster observerades med en confocal mikroskopi⁹. Mitokondriellt grön fluorescerande sond kan användas för att färga levande celler. Jämfört med rhodamin 123 eller JC-1, mitokondriellt grön fluorescerande sond inte beroende av mitokondriellt membran potential för mitokondriellt färgning. ATP-nivåer fastställdes av en luciferas-luciferin kit och normaliseras av protein koncentration. ATP-analyssats kan användas för att detektera ATP-nivåer i vanliga lösningar, celler eller vävnader. Detta kit är baserat på firefly luciferase katalyseras av fluorescein för att generera fluorescens, när ATP krävs för att ge energi. När firefly luciferas och fluorescein är överdriven, i ett visst koncentrationsområde, är generering av fluorescens proportionell mot koncentrationen av ATP. Dessutom har detta kit speciellt utformats för att optimera chemiluminescens av ATP. ATP, som de viktigaste energimolekylerna, spelar en viktig roll i cellernas olika fysiologiska eller patologiska processer. Förändringar i ATP-nivåer kan återspegla defekter i cellfunktion, särskilt mitokondriell energiproduktion. Vanligtvis under apoptos, nekros eller i något giftigt tillstånd, cellulära ATP-nivåer minskat ¹⁰. MMPs-assay kit med JC-1 är ett kit som använder JC-1 som en fluorescerande sond för att upptäcka celler, vävnader eller renas MMPs snabbt och känsligt. Det kan användas för tidig upptäckt av apoptos. Det katjoniska färgämnet JC-1 är en fluorescerande sond som används för att upptäcka MMP som kan analyseras under flödescytometri indikeras av förändringar av grön och röd fluorescensförhållande. När MMP är hög, JC-1 aggregeras i matrisen av mitokondrierna att bilda en polymer (J-aggregat), som producerar röda fluorescens. När MMP är låg, JC-1 kan inte ackumuleras, och bildar monomer som producerar grön fluorescens¹¹. Så förhållandet mellan rött och grönt fluorescens kan återspegla nivån på MMP. Cellernas OCR är en avgörande indikator på normal cellulär funktion¹². Det betraktas som en parameter till forskning mitokondriefunktion. Cells mito stresstestsats ger en stabil metod för att analysera nyckelparametrar av mitokondriell funktion. Satsen ger kvalitetskontroll och prediktiva reagenser samt en standardmetod för att utföra cellmitokondriellt stresstest. Det kan användas för att upptäcka alla celltyper, inklusive primära celler, cellinjer, upphängda celler, och även för holmar, nematoder, jäst och isolerade mitokondrier.

OCR-mätning kan ge värdefull insikt i cellernas fysiologiska status eller ombyggnader. det fastställdes med en extracellulära flux analysator för att upptäcka andning baslinjen, proton läcka, maximal luftvägarna, ATP omsättning och reserv kapacitet. I korthet, efter baslinjemätningar av OCR, upptäcktes OCR efter att sekventiellt lägga till oligomycin (ATP Coupler), FCCP (mitokondriellt oxidativ phosphorylation uncoupler) och antimycin A/rotenone (en hämmare av syreförbrukning)per brunn.

I ett försök att underlätta utvecklingen av mer specifika protokoll för att upptäcka mitokondriell funktion i hepatocyter in vitro, presenterar vi här experiment av TEM, confocal mikroskopi, luminometer, flödescytometri och extracellulära flux analysator med framtida tillämpning i att studera mitokondrierna skada relaterade negativa resultat.