Effekten av organochlorine plantevernmidler (OCPs) på helse, f.eks reproduktive forstyrrelser, immunologisk toksisitet, metabolske endringer har tidligere blitt studert^1,2,3. Metodene for å oppdage cellulær metabolisme og finne ut mitokondriedysfunksjon har gjort det mulig for forskere å forstå rollen som mitokondriefunksjon (det vil si., mitokondrie-STAT3-nivåer, laktat, pyruvat, laktat-til-pyruvatforhold, koenzym Q10, mitokondrieprotonlekkasje, bioenergetika, biogenese og dynamikk) på områder som aldring, fedme, diabetes, kardiovaskulær funksjon, kreft og sikkerhetstoksisitet^4,5,,6,,7.^, I dette papiret beskriver vi metodene for å vurdere mitokondriedysfunksjon forårsaket av OCPer.

Vi eksponerte HepG2-celler for β-heksaklokloheksan (β-HCH), en representativ OCPs, i 24 timer ved en dose tilsvarende intern eksponering av mennesker. For det første ble TEM brukt til å observere ultrastrukturen av hepatocytter, som kjerner, mitokondrier og endoplasmaisk retikuulum⁸. Sammenlignet med vanlige mikroskoper, gjør TEM det mulig å utforske 2D og 3D ultra-struktur av celler og cellekomponenter (cellelinjer eller vev), morfologi, kjemisk sammensetning, samt funksjon av naturlige eller kunstige materialer som spiller en avgjørende rolle i moderne vitenskap og teknologi. Mitokondriefunksjonen ble videre evaluert av mitokondriefluorescensintensitet, adenosin 5′-trifosfat (ATP) nivåer, oksygenforbruk (OCR) og mitokondriemembran potensial (MMP) i HepG2 celler inkubert med β-HCH. Mito-tracker grønn er en mitokondrier grønn fluorescerende sonde som kan brukes til levende celle mitokondrie-spesifikke fluorescerende farging. Mitokondriene i hepatocytter ble farget av mito-tracker grønn løsning og mitokondriefluorescensintensitet, antall og mønster ble observert med en konfokal mikroskopi⁹. Mitokondriegrønn fluorescerende sonde kan brukes til å flekke levende celler. Sammenlignet med rhodamin 123 eller JC-1, er mitokondriegrønn fluorescerende sonde ikke avhengig av mitokondriemembran potensial for mitokondriefarging. ATP-nivåene ble bestemt av et luciferase-luciferin-sett og normalisert ved proteinkonsentrasjon. ATP analyse kit kan brukes til å oppdage ATP nivåer i vanlige løsninger, celler eller vev. Dette settet er basert på firefly luciferase katalysert av fluorescein for å generere fluorescens, når ATP er nødvendig for å gi energi. Når firefly luciferase og fluorescein er overdreven, i et visst konsentrasjonsområde, er generering av fluorescens proporsjonal med konsentrasjonen av ATP. I tillegg har dette settet blitt spesielt designet for å optimalisere chemiluminescensen til ATP. ATP, som de viktigste energimolekylene, spiller en viktig rolle i de ulike fysiologiske eller patologiske prosessene i celler. Endringer i ATP-nivåer kan gjenspeile feil i cellefunksjonen, spesielt mitokondrieenergiproduksjon. Vanligvis under apoptose, nekrose eller i noen giftig tilstand, reduserte cellulære ATP-nivåer ¹⁰. MMPs analyse kit med JC-1 er et sett som bruker JC-1 som en fluorescerende sonde for å oppdage celler, vev eller renset MMPs raskt og følsomt. Den kan brukes til tidlig påvisning av apoptose. Den kationiske fargestoff JC-1 er en fluorescerende sonde som brukes til å oppdage MMP som kan analyseres under strømningscytometri indikert av endringer i grønt og rødt fluorescensforhold. Når MMP er høy, er JC-1 aggregert i matrisen av mitokondriene for å danne en polymer (J-aggregater), som produserer rød fluorescens. Når MMP er lav, jc-1 kan ikke akkumuleres, og danner monomer som produserer grønn fluorescens¹¹. Så forholdet mellom rød og grønn fluorescens kan gjenspeile nivået av MMP. OCR av celler er en avgjørende indikator på normal cellulær funksjon¹². Det regnes som en parameter for forskning mitokondriefunksjon. Cellemito stress testsett gir en stabil metode for å analysere viktige parametere for mitokondriefunksjon. Settet gir kvalitetskontroll og prediktive reagenser samt en standard metode for å utføre celle mitokondriestresstest. Den kan brukes til å oppdage alle celletyper, inkludert primære celler, cellelinjer, suspenderte celler, og også for holmer, nematoder, gjær og isolerte mitokondrier.

OCR-måling kan gi verdifull innsikt i den fysiologiske statusen eller endringene i cellene. Det ble bestemt med en ekstracellulær fluxanalysator for å oppdage puste baseline, protonlekkasje, maksimal respiratorisk, ATP-omsetning og reservekapasitet. Kort sagt, etter baseline målinger av OCR, ble OCR oppdaget etter sekvensielt å legge til oligomycin (ATP-kobling), FCCP (mitokondrieoksidativ fosforyler) og antimycin A / rotenon (en hemmer av oksygenforbruk) per brønn.

I et forsøk på å lette utviklingen av mer spesifikk protokoll for å oppdage mitokondriefunksjon i hepatocytter in vitro, presenterer vi her eksperimenter av TEM, konfokal mikroskopi, luminometer, strømningscytometri og ekstracellulær fluksaysator med fremtidig anvendelse i å studere mitokondrier skaderelaterte uønskede resultater.