유기체 살충제에 노출된 간세포에서 미토콘드리아 기능을 검출하기 위한 실험 프로토콜
Summary
간세포에서 미토콘드리아 기능에 대한 환경 유기염소농약(OCP)의 영향을 이해하는 것은 대사 장애를 일으키는 OCP의 메커니즘을 탐구하는 데 중요합니다. 이 논문은 간 미토콘드리아 기능을 검출하는 방법에 대한 자세한 방법을 제시합니다.
Abstract
이 논문은 간세포에서 환경 유기염소 살충제 (OCP)로 인한 대사 장애의 원인을 더 잘 이해하기 위해 간 미토콘드리아 기능을 검출하는 방법에 대한 자세한 방법을 제시합니다. HepG2 세포는 β-헥사클로로시클로헥산(β-HCH)에 24시간 동안 일반 집단에서 내부 노출의 동등한 용량으로 노출되었다. 간세포내의 초구조는 미토콘드리아의 손상을 나타내기 위해 전염 전자 현미경 검사(TEM)에 의해 검사되었다. 미토콘드리아 기능은 β-HCH로 배양된 HepG2 세포에서 미토콘드리아 형광 강도, 아데노신 5′-triphosphate(ATP) 수준, 산소 소비율(OCR) 및 미토콘드리아 막 전위(MMP)에 의해 추가적으로 평가되었다. 미토콘드리아 녹색 형광 프로브에 의해 염색된 후 미토콘드리아 형광 강도는 형광 현미경검사로 관찰되었다. 루시페린 루시파라제 반응은 ATP 수준을 결정하는 데 사용되었다. MMP는 양이온염 JC-1에 의해 검출되고 유동 세포측정하에 분석되었다. OCR은 세포외 플럭스 분석기로 측정되었다. 요약하자면, 이러한 프로토콜은 미토콘드리아 손상을 조사하기 위해 간세포에서 미토콘드리아 기능을 검출하는 데 사용되었습니다.
Introduction
생식 간섭, 면역 독성, 대사 변화 등 건강에 대한 유기염소살충제(OCP)의 효과는 이전에1,,2,,3을연구하였다. 세포 대사를 감지하고 미토콘드리아 기능 장애를 알아내는 방법은 과학자들이 미토콘드리아기능(즉)역할을 이해할 수 있게 해 주었다. , 미토콘드리아 STAT3 수준, 젖산, 피루바테, 젖산염-피루바테 비율, 코엔자임 Q10, 미토콘드리아 양성자 누출, 생체 에너지, 생체 발생, 심혈관 기능, 암 및 안전 독성4,,55,6,,7. 이 논문에서는 OCP에 의한 미토콘드리아 기능 장애를 평가하는 방법을 설명합니다.
우리는 HepG2 세포를 β-헥사클로로클로헥산(β-HCH)에 노출시켰다( β-HCH), 하나의 대표적인 OCP, 24h는 인간의 내부 노출에 상응하는 용량으로. 먼저, TEM은 핵, 미토콘드리아 및 내피 성 망상8과같은 간세포의 초구조를 관찰하도록 적용되었다. 일반적인 현미경과 비교하여, TEM은 세포 및 세포 성분 (세포주 또는 조직), 형태학, 화학 조성뿐만 아니라 현대 과학 및 기술에서 중추적 인 역할을하는 천연 또는 인공 물질의 기능을 2D 및 3D 초구조를 탐구 할 수 있습니다. 미토콘드리아 기능은 β-HCH로 배양된 HepG2 세포에서 미토콘드리아 형광 강도, 아데노신 5′-triphosphate(ATP) 수준, 산소 소비율(OCR) 및 미토콘드리아 막 전위(MMP)에 의해 더욱 평가되었다. 미토 트래커 그린은 미토콘드리아 그린 형광 프로브로, 살아있는 세포 미토콘드리아 특이적 형광 염색에 사용할 수 있다. 간세포내의 미토콘드리아는 미토트래커 그린 용액과 미토콘드리아 형광 강도, 수 및 패턴에 의해 염색되어 공초점 현미경9로관찰되었다. 미토콘드리아 녹색 형광 프로브는 살아있는 세포를 얼룩지게 하는 데 사용할 수 있습니다. 로다민 123 또는 JC-1과 비교하여 미토콘드리아 녹색 형광 프로브는 미토콘드리아 염색을 위한 미토콘드리아 막 잠재력에 의존하지 않습니다. ATP 수준은 루시파아제-루시페린 키트에 의해 결정되었고 단백질 농도에 의해 정상화되었다. ATP 분석 키트는 일반적인 해결책, 세포 또는 조직에서 ATP 수준을 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 이 키트는 ATP가 에너지를 제공해야 할 때 형광을 생성하기 위해 형광에 의해 촉매된 반딧불 루시파아제를 기반으로 합니다. 반딧불이 루시파라제와 형광이 과도한 경우, 특정 농도 범위에서, 형광의 생성은 ATP의 농도에 비례한다. 또한 이 키트는 ATP의 화학 발광을 최적화하기 위해 특별히 설계되었습니다. ATP는 가장 중요한 에너지 분자로서 세포의 다양한 생리학적 또는 병리학 적 과정에 중요한 역할을합니다. ATP 수준에 있는 변경은 세포 기능에 있는 결점을 반영할 수 있습니다, 특히 미토콘드리아 에너지 생산. 일반적으로 세포 사멸, 괴사 또는 일부 독성 상태에서, 세포 ATP 수준은 10감소. JC-1을 사용한 MmPs 분석 키트는 JC-1을 형광 프로브로 사용하여 세포, 조직 또는 정제된 MmP를 빠르고 민감하게 감지하는 키트입니다. 그것은 apoptosis의 조기 검출을 위해 사용될 수 있습니다. 양이온염액 JC-1은 녹색 및 적색 형광비의 변화에 의해 표시된 유동 세포측정하에서 분석될 수 있는 MMP를 검출하는 데 사용되는 형광 프로브이다. MMP가 높을 때, JC-1은 적색 형광을 생성하는 중합체(J-aggregates)를 형성하기 위해 미토콘드리아의 매트릭스에 응집된다. MMP가 낮으면 JC-1이 축적될 수 없으며 녹색형광(11)을생성하는 단조량체를 형성한다. 따라서 적색 및 녹색 형광의 비율은 MMP의 수준을 반영할 수 있습니다. 세포의 OCR은 정상적인 세포기능(12)의중요한 지표이다. 미토콘드리아 기능을 연구하기 위한 매개변수로 간주됩니다. 세포 미토 스트레스 테스트 키트는 미토콘드리아 기능의 주요 파라미터를 분석하는 안정적인 방법을 제공합니다. 이 키트는 품질 관리 및 예측 시약뿐만 아니라 세포 미토콘드리아 응력 테스트를 수행하는 표준 방법을 제공합니다. 그것은 1 차세포, 세포주, 중단된 세포를 포함하여 모든 세포 모형을 검출하기 위하여 이용될 수 있고, 또한 섬, 선충, 효모 및 고립된 미토콘드리아를 위해 이용될 수 있습니다.
OCR 측정은 세포의 생리적 상태 또는 변경에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 호흡 기준선, 양성자 누출, 최대 호흡, ATP 회전율 및 예비 용량을 검출하기 위해 세포외 플럭스 분석기로 결정되었습니다. 간단히 말해서, OCR의 기준선 측정 후, OCR은 올리고마이신(ATP 커플러), FCCP(미토콘드리아 산화 인산화 비커플기) 및 항마이신 A/로테네톤(산소 소비 억제제)에 순차적으로 첨가한 후 검출되었다.
시험관내 간세포에서 미토콘드리아 기능을 검출하기 위한 보다 구체적인 프로토콜의 개발을 용이하게 하기 위해, 우리는 미토콘드리아 손상 관련 불리한 결과를 연구하는 향후 응용 프로그램과 함께 TEM, 공초점 현미경, 발광계, 유동 세포측정및 세포외 플럭스 분석기의 실험을 여기에 제시한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
검출 프로토콜의 성공에 중요한 것은 표현형에서 메커니즘에 이르는 연구를 다루어온 다양한 실험 적 방법의 사용입니다. 이 연구에서, HepG2 세포는 페니실린과 연쇄상 구균 및 10% 태아 소 혈청으로 DMEM에서 배양되었습니다. 세포가 40-50% 합류에 도달하면 β-HCH(0, 10, 100 ng/mL)를 24시간 동안 첨가하고 배양하였다. 먼저 대표적인 OCP, β-HCH에 의한 간세포의 초구조적 변화를 보여 미토콘드리아 구조의 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (그랜트 Nos. 81573174, 81570574)에 의해 지원되었다; 장쑤성 우수 청년기금(SBK2014010296); 중국 교육부 연구 프로젝트 (213015A); 장쑤 고등 교육 기관의 우선 학술 프로그램 개발 (PAPD), 강서 고등 교육 기관의 주력 주요 개발; 및 환경 화학 및 생태 독성학의 국가 핵심 연구소의 오픈 프로젝트 프로그램 (KF2015-01).
Materials
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining. |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 700B | The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image. |
| Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader be used to detect protein consentration. |
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