ऑर्गेनोक्लोरीन कीटनाशकों के संपर्क में हेपेटोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का पता लगाने के लिए प्रायोगिक प्रोटोकॉल
Summary
हेपेटोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन पर पर्यावरणीय ऑर्गेनोक्लोरीन कीटनाशकों (ओसीपी) के प्रभाव को समझना मेटाबोलिक विकारों के कारण ओसीपी के तंत्र की खोज में महत्वपूर्ण है। यह पेपर हेपेटिक माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का पता लगाने के लिए विस्तृत तरीके प्रस्तुत करता है।
Abstract
यह पेपर हेपेटोसाइट्स में पर्यावरणीय ऑर्गेनोक्लोरीन कीटनाशकों (ओसीपी) के कारण मेटाबोलिक विकारों के कारण बेहतर समझने के लिए हेपेटिक माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का पता लगाने के लिए विस्तृत तरीके प्रस्तुत करता है। हेपजी2 कोशिकाओं को सामान्य आबादी में आंतरिक जोखिम की समकक्ष खुराक पर 24 घंटे के लिए 24 घंटे के लिए ए-हेक्साक्लोरोसाइक्लोएक्लाजेन (ए-एचसीएच) के संपर्क में किया गया था। माइटोकॉन्ड्रिया के नुकसान को दिखाने के लिए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) द्वारा हेपेटोसाइट्स में अल्ट्रास्ट्रक्चर की जांच की गई थी। माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन माइटोकॉन्ड्रियल फ्लोरेसेंस तीव्रता, एडेनोसाइन 5′-ट्रिप्होस्फेट (एटीपी) स्तर, ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) और हेपजी2 कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमएमपी) द्वारा मूल्यांकन किया गया था। माइटोकॉन्ड्रिया फ्लोरेसेंस तीव्रता माइटोकॉन्ड्रियल ग्रीन फ्लोरोसेंट जांच से दागने के बाद फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ देखा गया। लूसिफ़ेरिन-लूसिफ़ेरेस प्रतिक्रिया का उपयोग एटीपी स्तर निर्धारित करने के लिए किया गया था। एमएमपी को cationic डाई जेसी-1 द्वारा पता लगाया गया था और प्रवाह साइटोमेट्री के तहत विश्लेषण किया गया था। ओसीआर को एक एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर के साथ मापा गया था। संक्षेप में, इन प्रोटोकॉल का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया नुकसान की जांच करने के साथ हेपेटोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का पता लगाने में किया गया था।
Introduction
स्वास्थ्य पर ऑर्गेनोक्लोरीन कीटनाशकों (ओसीपी) के प्रभाव, जैसे प्रजनन हस्तक्षेप, प्रतिरक्षा विषाक्तता, मेटाबोलिक परिवर्तनों का पहले अध्ययन किया गया है1,,2,,3। सेलुलर मेटाबोलिज्म का पता लगाने और माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन का पता लगाने के तरीकों ने वैज्ञानिकों को माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शन(यानी)की भूमिका को समझने में सक्षम बनाया है । , माइटोकॉन्ड्रियल स्टेट3 स्तर, लैक्टेट, पायरुवेट, लैक्टेट-टू-पाइरुवेट अनुपात, कोएंजाइम क्यू10, माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटोन रिसाव, बायोनेरेग्नेटिक्स, बायोजेनेसिस, और गतिशीलता) उम्र बढ़ने, मोटापा, मधुमेह, हृदय समारोह, कैंसर, और सुरक्षा विषाक्तता4,,5,,6,,7जैसे क्षेत्रों में। इस पेपर में, हम ओसीपी के कारण माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन का आकलन करने के तरीकों का वर्णन करते हैं।
हमने मानव के आंतरिक जोखिम के बराबर खुराक पर 24 घंटे के लिए हेपजी2 कोशिकाओं को एक प्रतिनिधि ओसीपी (ए-एचसीएच) में उजागर किया। सबसे पहले, टेम को न्यूक्लियी, माइटोकॉन्ड्रिया और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम8जैसे हेपेटोसाइट्स की अल्ट्रास्ट्रक्चर का पालन करने के लिए लागू किया गया था। साधारण माइक्रोस्कोप की तुलना में, TEM कोशिकाओं और सेल घटकों (सेल लाइनों या ऊतक), आकृति विज्ञान, रासायनिक संरचना, साथ ही प्राकृतिक या कृत्रिम सामग्री के कार्य की 2डी और 3डी अल्ट्रा-स्ट्रक्चर का पता लगाने में सक्षम बनाता है जो आधुनिक विज्ञान और प्रौद्योगिकी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन माइटोकॉन्ड्रियल फ्लोरेसेंस तीव्रता, एडेनोसाइन 5′-ट्रिप्होस्फेट (एटीपी) स्तर, ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) और हेपजी2 कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमएमपी) द्वारा मूल्यांकन किया गया था। मिंटो-ट्रैकर ग्रीन एक माइटोकॉन्ड्रिया ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोब है जिसका उपयोग लाइव सेल माइटोकॉन्ड्रियल-विशिष्ट फ्लोरोसेंट स्टेनिंग के लिए किया जा सकता है। हेपेटोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रिया को मिटो-ट्रैकर ग्रीन सॉल्यूशन और माइटोकॉन्ड्रियल फ्लोरेसेंस तीव्रता, संख्या और पैटर्न से दाग दिया गया था, एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 9 के साथदेखागया था। माइटोकॉन्ड्रियल ग्रीन फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग जीवित कोशिकाओं को दागने के लिए किया जा सकता है। रोडामाइन 123 या जेसी-1 की तुलना में, माइटोकॉन्ड्रियल ग्रीन फ्लोरोसेंट जांच माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता पर निर्भर नहीं करती है। एटीपी का स्तर एक लूसिफ़ेरेस-लूसिफ़ेरिन किट द्वारा निर्धारित किया गया था और प्रोटीन एकाग्रता द्वारा सामान्यीकृत किया गया था। एटीपी परख किट आम समाधान, कोशिकाओं या ऊतकों में एटीपी के स्तर का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह किट फ्लोरोसेंस उत्पन्न करने के लिए फ्लोरोसेसिन द्वारा उत्प्रेरित जुगनू लूसिफ़ेरेस पर आधारित है, जब एटीपी को ऊर्जा प्रदान करने की आवश्यकता होती है। जब जुगनू लूसिफ़ेरेस और फ्लोरोसीन अत्यधिक होते हैं, तो एक निश्चित एकाग्रता सीमा में, फ्लोरेसेंस की पीढ़ी एटीपी की एकाग्रता के आनुपातिक होती है। इसके अलावा इस किट को खासतौर पर एटीपी के केमिल्यूमिनेसेंस को ऑप्टिमाइज करने के लिए डिजाइन किया गया है। एटीपी, सबसे महत्वपूर्ण ऊर्जा अणुओं के रूप में, कोशिकाओं की विभिन्न शारीरिक या रोग प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एटीपी के स्तर में परिवर्तन सेल समारोह में दोषों को प्रतिबिंबित कर सकते हैं, विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा उत्पादन। आमतौर पर एपोप्टोसिस, नेक्रोसिस या कुछ विषाक्त स्थिति में, सेलुलर एटीपी का स्तर 10कम हो जाता है। जेसी-1 के साथ एमएमपीएस परख किट एक किट है जो कोशिकाओं, ऊतकों या शुद्ध एमएमपी का जल्दी और संवेदनशीलता से पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट जांच के रूप में जेसी-1 का उपयोग करती है। इसका उपयोग एपोप्टोसिस का जल्दी पता लगाने के लिए किया जा सकता है। cationic डाई जेसी-1 एक फ्लोरोसेंट जांच है जिसका उपयोग एमएमपी का पता लगाने के लिए किया जाता है जिसका विश्लेषण हरे और लाल फ्लोरेसेंस अनुपात के परिवर्तनों द्वारा इंगित प्रवाह साइटोमेट्री के तहत किया जा सकता है। जब एमएमपी अधिक होता है, तो जेसी-1 को माइटोकॉन्ड्रिया के मैट्रिक्स में एक बहुलक (जे-एग्रीगेट्स) बनाने के लिए एकत्रित किया जाता है, जो लाल फ्लोरेसेंस पैदा करता है। जब एमएमपी कम होता है, तो जेसी-1 जमा नहीं हो सकता है, और मोनोमर बनाता है जो हरे रंग की फ्लोरेसेंस11का उत्पादन करता है। इसलिए लाल और हरे रंग के फ्लोरेसेंस का अनुपात एमएमपी के स्तर को प्रतिबिंबित कर सकता है। कोशिकाओं का ओसीआर सामान्य सेलुलर कार्य का एक महत्वपूर्ण संकेतक है12. यह माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन पर शोध करने के लिए एक पैरामीटर माना जाता है। सेल मिटो तनाव परीक्षण किट माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के प्रमुख मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए एक स्थिर विधि प्रदान करता है। किट गुणवत्ता नियंत्रण और भविष्य कहनेवाला अभिकर्मक के साथ ही सेल माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण प्रदर्शन के लिए एक मानक विधि प्रदान करता है । इसका उपयोग प्राथमिक कोशिकाओं, सेल लाइनों, निलंबित कोशिकाओं और आइलेट्स, नेमाटोड, खमीर और अलग माइटोकॉन्ड्रिया सहित सभी कोशिका प्रकारों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।
ओसीआर माप कोशिकाओं की शारीरिक स्थिति या परिवर्तन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। यह सांस लेने की आधार रेखा, प्रोटोन रिसाव, अधिकतम श्वसन, एटीपी कारोबार और आरक्षित क्षमता का पता लगाने के लिए एक बाह्राश प्रवाह विश्लेषक के साथ निर्धारित किया गया था । संक्षेप में, ओसीआर के बेसलाइन माप के बाद, ओसीआर को क्रमिक रूप से ओलिगोमाइसिन (एटीपी कपलर), एफसीसीपी (माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन अनकूपलर) और एंटीमाइसिन ए/रोटेनोन (ऑक्सीजन खपत का अवरोधक) प्रति अच्छी तरह से जोड़ने के बाद पता चला ।
विट्रो में हेपेटोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का पता लगाने के लिए अधिक विशिष्ट प्रोटोकॉल के विकास को सुविधाजनक बनाने के प्रयास में, हम यहां टेम, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, ल्यूमिनोमीटर, फ्लो साइटोमेट्री और एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर द्वारा माइटोकॉन्ड्रिया क्षति से संबंधित प्रतिकूल परिणामों का अध्ययन करने में भविष्य के आवेदन के साथ प्रयोग प्रस्तुत करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
डिटेक्शन प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण विभिन्न प्रकार के प्रयोगात्मक तरीकों का उपयोग है जिन्हें फेनोटाइप से तंत्र तक अध्ययन को कवर किया गया है। इस अध्ययन में, हेपजी2 कोशिकाओं को पेनिसिलिन और स?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (ग्रांट नग 81573174, 81570574) द्वारा समर्थित किया गया था; जियांग्सू प्रांत का बकाया युवा कोष (SBK2014010296); चीनी शिक्षा मंत्रालय की अनुसंधान परियोजना (213015A); जियांग्सू उच्च शिक्षा संस्थानों (पीएपीडी) का प्राथमिकता अकादमिक कार्यक्रम विकास, जियांग्सू उच्च शिक्षा संस्थानों का प्रमुख प्रमुख विकास; और पर्यावरण रसायन विज्ञान और इकोटॉक्सिकोलॉजी (KF2015-01) की राज्य कुंजी प्रयोगशाला का खुला परियोजना कार्यक्रम।
Materials
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining. |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 700B | The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image. |
| Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader be used to detect protein consentration. |
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