Virkningerne af organiske chlorpesticier (OCP’ er) på sundheden,^1,2,f.eks. e.g. Metoderne til at opdage cellulære stofskifte og finde ud af mitokondriel dysfunktion har gjort det muligt for forskerne at forstå den rolle, mitokondrielle funktion(dvs., mitokondrielSTAT3 niveauer, laktat, pyruvat, laktat-til-pyruvat ratio, coenzym Q10, mitokondrielle proton lækage, bioenergeti, biogenese, og dynamik) på områder som aldring, fedme, diabetes, hjerte-kar-funktion, kræft, og sikkerhed^{toksicitet 4,5,6,7}. I dette dokument beskriver vi metoderne til vurdering af mitokondriel dysfunktion forårsaget af OCPs.

Vi eksponerede HepG2-celler for β-hexachlorcyclohexane (β-HCH), en repræsentativ OCPs, i 24 timer ved en dosis svarende til intern eksponering af mennesker. For det første blev TEM anvendt til at observere hepatocytternes ultrastruktur, såsom kerner, mitokondrier og endoplasmatisk reticulum⁸. Sammenlignet med almindelige mikroskoper gør TEM det muligt at udforske 2D- og 3D-ultrastrukturen af celler og cellekomponenter (cellelinjer eller væv), morfologien, den kemiske sammensætning samt funktionen af naturlige eller kunstige materialer, der spiller en central rolle i moderne videnskab og teknologi. Mitokondriel funktion blev yderligere evalueret ved mitokondriel fluorescensintensitet, adenosin 5′-tripfosfat (ATP) niveauer, iltforbrug (OCR) og mitokondrielle membran potentiale (MMP) i HepG2 celler inkuberet med β-HCH. Mito-tracker grøn er en mitokondrier grøn fluorescerende sonde, der kan bruges til levende celle mitokondrielle-specifikke fluorescerende farvning. Mitokondrierne i hepatocytter blev plettet af mito-tracker grøn opløsning og mitokondrielle fluorescens intensitet, antal og mønster blev observeret med en konfokal mikroskopi⁹. Mitokondrielle grønne fluorescerende sonde kan bruges til at plette levende celler. Sammenlignet med rhodamin 123 eller JC-1, mitokondrielle grønne fluorescerende sonde afhænger ikke af mitokondrielle membran potentiale for mitokondriel farvning. ATP niveauer blev bestemt af en luciferase-luciferin kit og normaliseret ved proteinkoncentration. ATP assay kit kan bruges til at opdage ATP niveauer i fælles løsninger, celler eller væv. Dette kit er baseret på firefly luciferase katalyseret af fluorescein at generere fluorescens, når ATP er forpligtet til at levere energi. Når firefly luciferase og fluorescein er overdreven, i en vis koncentration rækkevidde, generering af fluorescens er proportional med koncentrationen af ATP. Desuden er dette kit specielt designet til at optimere chemiluminescens af ATP. ATP, som de vigtigste energimolekyler, spiller en vigtig rolle i de forskellige fysiologiske eller patologiske processer i celler. Ændringer i ATP-niveauer kan afspejle fejl i cellefunktionen, især mitokondriel energiproduktion. Normalt under apoptose, nekrose eller i nogle giftige tilstand, cellulære ATP niveauer reduceret ¹⁰. MMPs assay kit med JC-1 er et kit, der bruger JC-1 som en fluorescerende sonde til at opdage celler, væv eller renset MMPs hurtigt og følsomt. Det kan bruges til tidlig påvisning af apoptose. Det kationiske farvestof JC-1 er en fluorescerende sonde, der anvendes til at detektere MMP, som kan analyseres under flowcytometri angivet ved ændringer af grønt og rødt fluorescensforhold. Når MMP er høj, er JC-1 aggregeret i matrix af mitokondrier til at danne en polymer (J-aggregater), som producerer rød fluorescens. Når MMP er lav, JC-1 kan ikke akkumulere, og danner monomer, der producerer grøn fluorescens¹¹. Så forholdet mellem rød og grøn fluorescens kan afspejle niveauet af MMP. OCR af celler er en afgørende indikator for normal cellulær funktion¹². Det betragtes som et parameter til forskning mitokondrielle funktion. Cell mito stress test kit giver en stabil metode til at analysere centrale parametre for mitokondrielle funktion. Sættet giver kvalitetskontrol og prædiktive reagenser samt en standard metode til at udføre celle mitokondrielle stresstest. Det kan bruges til at detektere alle celletyper, herunder primære celler, cellelinjer, suspenderede celler, og også for holme, nematoder, gær og isolerede mitokondrier.

OCR-måling kan give værdifuld indsigt i cellernes fysiologiske status eller ændringer. Det blev bestemt med en ekstracellulær flux analysator til at opdage vejrtrækning baseline, proton lækage, maksimal respiratorisk, ATP omsætning og reservekapacitet. Kort sagt, efter baseline målinger af OCR, OCR blev påvist efter sekventielt at tilføje til oligomycin (ATP Coupler), FCCP (mitokondriel oxidativ fosforylation uncoupler) og antimycin A/rotenon (en hæmmer af iltforbrug) per brønd.

I et forsøg på at lette udviklingen af mere specifik protokol til påvisning mitokondriel funktion i hepatocytter in vitro, præsenterer vi her eksperimenter med TEM, konfokal mikroskopi, luminometer, flow cytometri og ekstracellulære flux analysator med fremtidig anvendelse i at studere mitokondrier skader relaterede negative resultater.