Quantitative Messung der γ-Sekretase-vermittelten Amyloid-Precursor-Protein und Notch Spaltung in zellbasierten Luciferase Reporter Assay Plattformen

Oligomere Formen von Amyloid-β (Aβ) sind vermutlich die Hauptursache für Neurodegeneration in den Gehirnen von Patienten mit Alzheimer-Krankheit (AD)¹. Aβ-Peptide werden durch die schrittweise Spaltung des Amyloid-Precursor-Protein (APP), zuerst durch β-Sekretase und dann durch γ-Sekretase²produziert. In den letzten zehn Jahren haben therapeutische Ansätze zur Behandlung der AD zur Verhinderung der Aβ Produktion³konzentriert. Die meisten Studien konzentrierten sich auf entweder die Vermehrung der α-Sekretase Aktivität, die γ-Sekretase Spaltung des APP schließt und dadurch verringern die Produktion von Aβ oder die Hemmung der β-und/oder γ-Sekretase Aktivitäten⁴. Leider sind nichtselektiven Hemmung β oder γ-Secretases führt zu unvermeidbaren Nebenwirkungen, die durch Störung der Tätigkeit der anderen physiologischen Substraten von β und γ-Sekretase^5,6. Neuere Studien haben im Hinblick auf γ-Sekretase-Inhibitoren die Entdeckung einer Reihe von chemischen und genetischen Modulatoren berichtet, die Aβ-Produktion beim ausüben vernachlässigbarer Auswirkungen auf die wesentlichen γ-Sekretase-vermittelten Verarbeitung von Notch^{7 regulieren können ,8,9,10,11,12}, jedoch erfolgreiche Therapie noch nicht entwickelt worden. So sind weitere systematische Bildschirme gerechtfertigt, um neuartige chemische und genetische Modifikatoren zu entdecken, die selektiv γ-Sekretase-vermittelten APP Verarbeitung modulieren kann.

Γ-Sekretase ist bekannt, mehr als 90 verschiedene Membran verankerte Proteine zu Spalten. Unter diesen Substraten ist Kerbe, deren Tätigkeit für Zelle Schicksal Entschlossenheit und Differenzierung während der Entwicklung¹³entscheidend. Selektiv modulierende γ-Sekretase-katalysierte APP Verarbeitung ohne wird Kerbe zu beeinträchtigen Verarbeitung wesentlich zur Minimierung Kerbe-bezogene Nebenwirkungen von γ-Sekretase-Inhibitoren, und diese Selektivität wird angenommen, dass ein primärer Faktor ist, dass die biologische Wirksamkeit von potenziellen γ-Sekretase Modulatoren für die chronische Behandlung von AD zu diktieren. Es wurden eine Reihe von Arylsulfonamide-Derivaten, wie GSI-953 (Begacestat) und BMS-708163 (Avagacestat), die gefunden wurden, potent und selektive Hemmung der γ-Sekretase^14,15auszustellen. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass die differenzielle Hemmung der γ-Sekretase Spaltung der APP und Kerbe mit einer quantitativen ELISA-basierten Test in Kombination mit in Vivo Validierung mithilfe von Zebrafisch¹⁶beobachtet werden kann. Darüber hinaus wurden zellbasierte Assays Paradigmen eingerichtet, an die potentielle Substrat Selektivität der γ-Sekretase in Richtung APP und Kerbe^17,18. Unter Verwendung von Protokollen zu den beschriebenen ähnlich hierin, wir haben vor kurzem entdeckt eine neuartige Klasse von (D)-Leucinamides, die γ-Sekretase Spaltung des APP mit Notch-schonende Selektivität¹⁹potent modulieren. Diese Sammlung von Studien bilden zusammen ein Proof-of-Concept unterstützt die Vorstellung, die die Substrat Selektivität/Verfügbarkeit der γ-Sekretase chemische Modulation und experimentelle Verifikation unterworfen werden können. Dieser Assay-Plattformen setzen jedoch häufig auf relativ niedrigen Durchsatz auslesen und arbeitsintensive Ansätze, die industriellen Standards für Drug Discovery-Programme nicht erfüllen könnte.

Wir haben vor kurzem zellbasierte Luciferase Reporter-gen Assays generiert, die quantitativ, die katalytische Aktivität der γ-Sekretase gegenüber zwei unterschiedliche Substrate, die 99-amino Acid C-terminale Fragment der APP (APP-C99) und der extrazellulären bestimmen Domain gelöscht Kerbe Peptid (NΔE). APP-C99 und NΔE haben weithin als direkte Substrate der γ-Sekretase in verschiedenen Tests eingesetzt. Homogen und konsistent Luciferase Reporter-gen Assays für die γ-Sekretase Spaltung des APP-C99 oder NΔE generieren, erzielten wir ein HEK abgeleitet stabile Zelllinie (CG), die konstitutiv eine Gal4 Projektträger-gesteuerte Firefly Luciferase Reporter (ausdrückt Gal4-Luc) und Gal4/VP16-Tags APP-C99 Schmelzverfahren Protein (C99-GV). Darüber hinaus erzielten wir ein weiteres HEK abgeleitet stabile Zelllinie (NG), die konstitutiv Gal4-Luc und Gal4/VP16-markierten NΔE (NΔE-GV) ausdrückt. Mit dieser neuartigen Substrat-spezifische γ-Sekretase-Assays, bieten wir jetzt eine Methode zu quantifizieren und die katalytische Aktivität der γ-Sekretase auf unterschiedlichen Substraten (APP-C99 in CG-Zellen) oder NΔE in NG Zellen zu unterscheiden. Darüber hinaus wurden die Substrat-spezifische γ-Sekretase-Assays entwickelt, um High-Content-Screening Plattformen förderlich sein. Diese neu erzeugten γ-Sekretase-Assays könnte den Weg für die Entdeckung des neuartigen γ-Sekretase Modulatoren ebnen, die kognitive Funktion zu verbessern könnte, durch die Unterdrückung von Aβ-Produktion ohne unerwünschte Kerbe Hemmung für die Behandlung der nächsten Generation zu entlocken der AD.