Rilevamento altamente sensibile e quantitativo delle proteine e loro isoforme dal metodo di messa a fuoco isoelettrica capillare
Summary
Messa a fuoco isoelettrica capillare è una tecnica di basati su anticorpi, ultrasensibile, alta velocità di trasmissione, consentendo la dettagliata caratterizzazione delle proteine e loro isoforme da campioni biologici estremamente piccoli. Di seguito viene descritto un protocollo per il rilevamento e la quantificazione delle proteine specifiche e loro isoforme in modo automatizzato e robotizzato.
Abstract
Immunoblotting è diventata una tecnica di routine in molti laboratori per la caratterizzazione di proteine da campioni biologici. Il seguente protocollo fornisce una strategia alternativa, capillare isoelettrico (cIEF), di messa a fuoco con molti vantaggi rispetto ai convenzionali immunoblotting. Si tratta di un metodo basati su anticorpi, automatico, rapido e quantitativo, in cui una procedura completa di macchiante occidentale si svolge all’interno di un capillare ultrasottile. Questa tecnica non richiede un gel per trasferire ad una membrana, rimozione delle macchie, o pellicole, che sono in genere necessari per immunoblotting convenzionali a raggi x. Qui, le proteine sono separate secondo la loro carica (punto isoelettrico; pI), utilizzando meno di un microlitro (400 nL) di lisato proteico totale. Dopo l’elettroforesi, proteine sono immobilizzate sulle pareti dei capillari di trattamento della luce ultravioletta, seguita da primario e secondario (perossidasi di rafano (HRP) coniugato) incubazione dell’anticorpo, cui l’associazione viene rilevato attraverso funzionalità migliorata chemiluminescenza (ECL), generando un segnale luminoso che può essere catturato e registrato da una telecamera di charge coupled device (CCD). L’immagine digitale può essere analizzato e quantificati (area del picco) utilizzando il software. Questa procedura di throughput elevato può gestire 96 campioni contemporaneamente; è altamente sensibile, con rilevazione di proteine nella gamma picogrammo; e produce risultati altamente riproducibili a causa di automazione. Tutti questi aspetti sono estremamente utili quando la quantità di campioni (ad esempio, campioni di tessuto e biopsie) è un fattore limitante. La tecnica ha anche applicazioni più ampie, tra cui lo screening di farmaci o anticorpi, scoperta del biomarcatore e scopi diagnostici.
Introduction
Messa a fuoco isoelettrica capillare (cIEF) è un test immunologico automatizzato, basato su capillare che risolve le proteine in base al loro costo1,2,3. È altamente riproducibile e in grado di risolvere le proteine e loro isoforme traduzionalmente modificate rapidamente e quantitativamente. Presenta un’alternativa ai metodi convenzionali come macchiare occidentale. Mentre macchiare occidentale è molto buono per confermare la presenza di abbondanti proteine in campioni facilmente accessibili; variabilità, il consumo di tempo e tutti i presenti la quantificazione accurata sfide, in particolare quando si esaminano i campioni di tessuto biologico. Infatti, la variabilità è un problema inerente a macchiarsi occidentale, come ci sono numerosi passi coinvolti, quali caricamento e funzionamento del gel di SDS-PAGE, il trasferimento delle proteine sulla membrana, incubazione con vari reagenti (ad es., primaria e secondaria anticorpi, ECL) e sviluppo sulla pellicola di raggi x4. Attualmente, la tecnica macchiante occidentale sta migliorando con l’implementazione di registrazione digitale dei segnali a chemiluminescenza (Western digital). Recentemente, è stato sviluppato un sistema automatizzato di macchiante occidentale, vale a dire il capillare occidentale, che è un sistema più hands-free e gel-libero. Il dosaggio intero è automatica dopo il caricamento di un piatto di campione (campioni con tutti i reagenti necessari) nel sistema3,4. Lo strumento eseguirà tutti i passaggi come la separazione delle proteine, immobilizzazione di proteine sulla parete capillare, le incubazioni dell’anticorpo, lava tra diverse fasi e sviluppo e quantificazione dei segnali a chemiluminescenza. Così, la procedura cIEF qui presentata fornisce una maggiore risoluzione e sensibilità.
Questo metodo è riservato, come segnali possono essere generati e quantificati da picogrammi di proteine1. L’alta sensibilità con eccellente riproducibilità rende questa tecnologia molto utile per l’analisi di campioni clinici. Può rilevare come pure distinguere post traduzionali (ad es., proteina fosforilata diverse isoforme) delle proteine. Questa tecnologia è stata utilizzata con successo per dissecare diversa segnalazione vie4,5 negli studi clinici con l’obiettivo di sviluppare nuove terapie cancro3, e ha grandi potenzialità per la scoperta di biomarcatori e droga di proteina .
Protocol
Representative Results
Discussion
Sensibilità e risoluzione delle proteine sono fondamentali per la ricerca di proteomica su campioni biologici. C’è grande valore nell’essere in grado di rilevare le proteine che sono presenti in piccole quantità nelle cellule. cIEF in grado di offrire una migliore sensibilità e risoluzione per la rilevazione di proteine e loro isoforme4.
Questa tecnologia è stata utilizzata con successo in molti proteomica research report5,<sup cl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’autore ringrazia la Prof. ssa Lena Claesson-Welsh, Università di Uppsala, in Svezia, per il suo sostegno per lo sviluppo di questo progetto. Inoltre, l’autore ringrazia Ross Smith e Lena Claesson-Welsh, Università di Uppsala per la loro lettura critica e suggerimenti per migliorare il manoscritto.
Materials
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
Referências
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