זיהוי רגיש מאוד, כמותית של חלבונים ושל שלהם איזופורמים בשיטה התמקדות לגירויי כאב נימי
Summary
התמקדות לגירויי כאב נימי הוא שיטת התפוקה נוגדן מבוסס, העדינה, גבוהה, המאפשרת אפיון מפורט של חלבונים ו שלהם איזופורמים של דגימות ביולוגיות קטן מאוד. להלן מתאר פרוטוקול זיהוי, כימות של חלבונים ספציפיים, איזופורמים שלהם באופן אוטומטי ו- robotized.
Abstract
Immunoblotting הפך להיות טכניקה שיגרתי במעבדות רבות עבור חלבון איפיון מ דגימות ביולוגיות. פרוטוקול הבאים מספק אסטרטגיית חלופיים, נימי לגירויי כאב תוך התמקדות (cIEF), עם יתרונות רבים בהשוואה ל- immunoblotting קונבנציונלי. זוהי שיטה נוגדן מבוססי אוטומטית, מהירה, כמותי שבו הליך שלם blotting המערבי מתקיים בתוך נימי ודק במיוחד. טכניקה זו לא דורשים ג’ל כדי להעביר קרום, בנוכחות אחר של שהכלים, או סרטים, אשר נדרשים בדרך כלל עבור immunoblotting קונבנציונלי רנטגן. כאן, החלבונים מופרדים לפי תשלום שלהם (נקודה איזואלקטרית; pI), שימוש פחות microliter (400 nL) סה כ החלבון lysate. לאחר אלקטרופורזה, חלבונים הם ותשמרו על גבי קירות נימי על ידי טיפול אור אולטרה סגול, ואחריו ראשיים ומשניים (חזרת peroxidase (HRP) מצומדת) נוגדן דגירה, שאת איגודו מתגלה דרך משופרת chemiluminescence (ECL), יצירת אות אור שניתן שנתפסו או נרשם על ידי מצלמה תשלום מצמידים מכשיר (CCD). התמונה הדיגיטלי ניתן לנתח, לכמת (אזור הפסגה) באמצעות תוכנה. הליך תפוקה גבוהה יכול להתמודד עם דגימות 96 בכל פעם; היא רגישה מאוד, עם זיהוי חלבון בטווח picogram; מפיק תוצאות מאוד לשחזור בגלל אוטומציה. כל ההיבטים האלה יקרים מאוד, כאשר הכמות של דגימות (למשל, דגימות רקמה, ביופסיות) הוא גורם מגביל. הטכניקה יש יישומים רחב יותר, כולל הקרנה של סמים או נוגדנים, גילוי סמן למטרות אבחון.
Introduction
התמקדות לגירויי כאב נימי (cIEF) היא מתכלה אוטומטיות, המבוססים על נימי הפותר חלבונים על בסיס שלהם תשלום1,2,3. זה מאוד לשחזור ובעל יכולת לפתרון חלבונים ו שלהם איזופורמים ששונה post-translationally במהירות, באופן כמותי. הוא מציג אלטרנטיבה שיטות קונבנציונליות כמו סופג המערבי. בעוד סופג המערבי הוא טוב מאוד עבור המאשרים את נוכחותם של חלבונים בשפע בדגימות נגיש; השתנות זמן הצריכה, כימות מדויק הנוכחי אתגרים, בפרט כאשר בחינת דגימות רקמה ביולוגית. אכן, השתנות זו בעיה פנימית ב סופג המערבי, שכן ישנם שלבים רבים מעורבים, כגון טעינת וריצה של ג’ל מרחביות-דף, העברה של חלבונים על גבי קרום, דגירה עם חומרים כימיים שונים (למשל., יסודי ותיכון נוגדנים, ECL), ופיתוח על גבי סרט צילום רנטגן4. עד מהרה, בטכניקה blotting המערבי משתפרת מימוש הקלטה דיגיטלי של אותות chemiluminescent (מערבונים דיגיטלי) לאחרונה, מערכת אוטומטית blotting המערבי פותחה, כלומר את נימי המערבי, אשר הוא יותר דיבורית ג’ל ללא מערכת. וזמינותו כולה היא אוטומטית לאחר הטעינה של צלחת מדגם (דגימות עם ריאגנטים נחוץ כל) לתוך מערכת3,4. הכלי יבצע את כל השלבים כמו הפרדת חלבונים, קיבעון של חלבונים על גבי קיר נימי, נוגדן incubations, שוטף בין שלבים שונים, ופיתוח כימות של הסימנים chemiluminescent. לפיכך, ההליך cIEF המובאת כאן מספק רזולוציה גבוהה ורגישות.
שיטה זו היא רגישה, ככל אותות יכול להיות שנוצר לכמת מן picograms של חלבונים1. רגישות גבוהה עם הפארמצבטית מעולה עושה את הטכנולוגיה הזו מאוד שימושי עבור ניתוח הקליני דגימות. זה יכול לזהות כמו גם להבחין בין שינוי translational פוסט (למשל, חלבונים phosphorylated שונים איזופורמים) של חלבונים. טכנולוגיה זו שימש בהצלחה לנתח שונים איתות המסלולים4,5 במחקרים קליניים במטרה לפתח הרפוי חדש בסרטן3, והיא בעלת פוטנציאל גדול עבור גילוי התרופות, סמן חלבון .
Protocol
Representative Results
Discussion
רגישות ורזולוציה של חלבונים מכריעים לחקר פרוטיאומיה מבנית דגימות ביולוגיות. יש ערך רב להיות מסוגלים לזהות חלבונים אשר נמצאים בכמויות דקה בתאים. cIEF יכולים להציע שיפור רגישות ורזולוציה לאיתור חלבונים ושלהם איזופורמים4.
טכנולוגיה זו שימש בהצלחה ב רבים פרוטיאומי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחבר תודה פרופסור לנה Claesson-ולש, אוניברסיטת אופסלה, שוודיה לתמיכה שלה לפיתוח הפרויקט. בנוסף, המחבר תודה רוס סמית, לינה Claesson-ולש, אוניברסיטת אופסלה קריאה ביקורתית, הצעות לשיפור כתב היד.
Materials
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
Referências
- O’Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
- Aspinall-O’Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
- Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
- Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).
- Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
- Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6 (2016).
- Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).
- Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).
