Обнаружения диагностических Epitope Зика вирус
Summary
В этом протоколе мы опишем способ обнаружить Зика вируса конкретные диагностических пептиды с использованием высокой плотности пептид microarray. Этот протокол readly могут быть адаптированы для других возникающих инфекционных заболеваний.
Abstract
Высокой плотности пептид microarrays позволяют скрининг более шести тысяч пептидов на слайде микроскопии единый стандарт. Этот метод может применяться для обнаружения наркотиков, идентификации терапевтической цели и развитие диагностики. Здесь мы представляем протокол для обнаружения конкретных диагностических пептиды Зика вирус (ZIKV), с использованием высокой плотности пептид microarray. Образец сыворотки крови человека, проверяется для ZIKV инфекции был инкубировали с высокой плотности пептид microarray, содержащий весь белок ZIKV, переведены на 3,423 уникальный 15 линейный (aa) выпарок с перекрытием 14-aa остатков печати в двух экземплярах. Окрашивание с различных вторичных антител в одном массиве, мы обнаружили пептидов, которые связывают иммуноглобулина М (IgM) и иммуноглобулина G (IgG) антител в сыворотке крови. Эти пептиды были отобраны для дальнейшей проверки экспериментов. В этом протоколе мы описываем стратегии для проектирования, обработки и анализа плотности пептид microarray.
Introduction
Зика вирус (ZIKV) диагноз на основании клинических симптомов является сложной потому, что он разделяет векторов, географического распределения и симптомы инфекции вируса денге и чикунгунья1. Учитывая риск неблагоприятных исходов беременности у женщин, инфицированных ZIKV во время беременности, важно проводить различие между 3 вирусов. Хотя текущий молекулярных диагностических тестов являются специфическими, они являются полезными только в крови или слюны в относительно короткий период острой инфекции2,3. Серологические анализы необходимы для диагностики за пределами этого первоначального периода инфекции4.
Развитие ZIKV конкретных серологического анализа сложных по двум причинам: во-первых, Зика антигены, которые иммунная система человека реагирует на данный момент не известно; и во-вторых, сохранение flaviviruses аминокислотных последовательностей побудить антитела перекрестной реактивности. Наша цель состояла в том, чтобы обнаружить уникальный ZIKV специфических пептидов, которые будут использоваться в диагностике. Для экрана пептид библиотек, охватывающих весь белков, включая фага, бактериальный, были разработаны различные подходы и дрожжи поверхность отображения,5,6,,78,9 10. Наша стратегия заключалась в использовании с высокой плотностью пептид microarray дна, которая позволяет быстрый и недорогой высокопроизводительный серологических показы11,12 и впоследствии идентифицированных пептиды могут использоваться для улучшения тока серологическим анализы для выявления ZIKV инфекции.
Этот протокол позволяет открытие Зика вируса конкретные диагностических пептиды с использованием высокой плотности пептид microarray (рис. 1). Высокой плотности пептид microarray дна был подготовлен с помощью технология печати лазерная пептида. Вся последовательность ZIKV белок, состоящий из 3,423 аминокислотных остатков на основе французской Полинезии штамм (GenBank: KJ776791.2), был напечатан на слайде стандартного стекла в блоках 15 линейных остатков с напуском 14 аминокислотных остатков в двух экземплярах для всего 6846 пептид пятен. В дополнение к весь Зика белка последовательности пептиды, microarray использует гриппа гемагглютинин пептидов (HA) для внутреннего контроля.
Зика проверяются позитивный образец сыворотки, полученные от центра Уодсворт (Олбани, NY), была использована для выявления конкретных иммуноглобулина М (IgM) и реактивная пептиды иммуноглобулина G (IgG). После инкубации с образцом на ночь, microarray витражи с вторичной флюрохром конъюгированных антител (IgM против человека или антигуманных IgG) и проанализированы на microarray сканера. Количественная оценка пятно света и пептида аннотации была выполнена с конкретного программного обеспечения, предоставляемого той же компанией, которая изготовлена microarray.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали протокол, используя microarray высокой плотности пептид, содержащий всю последовательность Зика вирус белка (Французской Полинезии штамм). Microarray был изготовлен печати 3,423 различных перекрывающихся линейной пептиды. Каждый пептид было 15 аминокислот и разнообразных остатками…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Текущая поддержка предоставляется Грант административные дополнение SBIR (небольшой бизнес инновационных исследований) от NIDCRR44 DE024456. NIDCR ВИЧ Грант, которая развилась из гранта U01 DE017855 NIDCR для развития подтверждающих точку ухода диагностики ВИЧ. Мы с благодарностью признаем Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) за ее техническую помощь и поддержку. Мы также благодарим NYU Langone медицинский центр для LI-COR Одиссея Imaging системы.
Materials
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
Referências
- Kelser, E. A. Meet dengue’s cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
- Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
- Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
- Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
- t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
- Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
- Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6 (2017).
- Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748 (2012).
- Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330 (2017).
- Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
- Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , (2013).
- Services, U. S. D. o. H. a. H. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).
- Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
- Stafford, P., et al. Physical Characterization of the “Immunosignaturing Effect”. Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
- Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
- Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).
