Zika Virus spécifique Diagnostic épitope découverte
Summary
Dans ce protocole, nous décrivons une technique pour découvrir Zika virus diagnostique des peptides spécifiques en utilisant un peptide haute densité « microarray ». Ce protocole peut readly être adapté pour d’autres maladies infectieuses émergentes.
Abstract
Puces à haute densité de peptide permettent le criblage de plus de six mille peptides sur une lame de microscope standard unique. Cette méthode peut être appliquée pour la découverte de médicaments, identification des cibles thérapeutiques et l’élaboration du diagnostic. Nous présentons ici un protocole pour découvrir Zika virus (ZIKV) diagnostic des peptides spécifiques en utilisant un peptide haute densité « microarray ». Un échantillon de sérum humain validé pour les infections ZIKV sont incubée avec un microarray peptides haute densité contenant l’ensemble des protéines ZIKV traduit en 3 423 unique 15 linéaire acides aminés (aa) les résidus avec un chevauchement de résidus 14-aa imprimé en double exemplaire. Coloration avec différents anticorps secondaires dans le même tableau, nous avons détecté des peptides qui lient l’immunoglobuline M (IgM) et les anticorps de l’immunoglobuline G (IgG) présents dans le sérum. Ces peptides ont été choisis pour plus des expériences de validation. Dans ce protocole, nous décrivons la stratégie suivie pour concevoir, traiter et analyser un microarray peptides haute densité.
Introduction
Diagnostic de virus (ZIKV) de zika basé sur les symptômes cliniques est difficile parce qu’elle partage des vecteurs, répartition géographique et des symptômes avec la Dengue et Chikungunya virus infection1. Étant donné le risque de résultats défavorables de la grossesse chez les femmes infectées par ZIKV pendant la grossesse, il est important de distinguer entre les 3 virus. Bien que les tests de diagnostics moléculaires actuels sont spécifiques, ils sont seulement utiles dans le sang ou la salive au cours de la période relativement courte de l’infection aiguë2,3. Analyses sérologiques sont essentiels pour le diagnostic en dehors de cette période initiale d’infection4.
Le développement d’un test sérologique spécifique de ZIKV est difficile pour deux raisons : tout d’abord, les antigènes de Zika répondant par le système immunitaire humain à ne sont pas actuellement connus ; et séquences d’acides aminés flavivirus seconde, conservée induisent la réactivité des anticorps. Notre objectif était de découvrir des peptides spécifiques ZIKV uniques à utiliser dans le diagnostic. Différentes approches ont été développées aux bibliothèques de peptide écran couvrant les protéines entières dont phage, bactérienne, et surface de levure afficher5,6,7,8,9, 10. Notre stratégie a consisté à utiliser un microarray peptides haute densité qui permet des projections de sérologique rapide et peu coûteuse haut débit11,12 , et par la suite les peptides identifiés peuvent être utilisés pour améliorer l’actuelle sérologique tests pour la détection de l’infection à ZIKV.
Ce protocole permet la découverte de Zika virus diagnostique des peptides spécifiques en utilisant un peptide haute densité « microarray » (Figure 1). La biopuce peptide haute densité a été produite à l’aide de la technologie d’impression laser peptide. La séquence entière de protéine ZIKV composé de 3 423 résidus d’acide aminé issu de la souche polynésienne Français (GenBank : KJ776791.2), a été imprimé sur une lame de verre standard dans des blocs de 15 résidus linéaires avec un chevauchement de 14 acides aminés en double exemplaire pour une total de 6 846 taches de peptide. Outre les peptides de séquence protéique Zika entières, la biopuce utilise hémagglutinine grippe peptides (HA) pour les contrôles internes.
Un Zika validé positive échantillon de sérum provenant de Wadsworth Center (Albany, NY), servait à identifier des immunoglobulines M (IgM) et peptides réactifs immunoglobuline G (IgG). Après incubation avec l’exemple du jour au lendemain, la biopuce était tachée avec un anticorps conjugué fluorochrome secondaire (anti-homme IgM ou anti-IgG humaines) et analysée sur un scanner de microarray. Quantification des intensités spots et annotation de peptide a été réalisée avec un logiciel spécifique fourni par la même société qui a fabriqué la biopuce.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons conçu un protocole utilisant un microarray peptides haute densité contenant la séquence entière de la protéine du virus Zika (souche polynésienne Français). La biopuce a été fabriquée par impression 3 423 différents peptides linéaires qui se chevauchent. Chaque peptide était 15 acides aminés et variait selon qu’un résidu de son voisin le plus proche dans la séquence (p. ex., résidus 14 chevauchement). Bien que chevauche plus courtes peut être imprimés, la cartographie des épitope…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Actuel est confortée par une subvention de supplément administratif SBIR (Small Business Innovation Research) de NIDCRR44 DE024456. Concession de NIDCR VIH qui a évolué hors subvention NIDCR U01 DE017855 pour le développement d’un diagnostic de point-of-care confirmation pour le VIH. Nous remercions sincèrement Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) pour son assistance technique et de soutien. Nous remercions également NYU Langone Medical Center pour les LI-COR Odyssey Imaging System.
Materials
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
Referências
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