低線量の毒性に萌芽期の露出の長期的な行動および生殖の影響

以下のプロトコルは、初期胚発生に伴う BPA 暴露の効果をテストするのには標準化されているし、BPS、BPF や他の内分泌かく乱化学物質とc. の elegans胚毒性物質との使用のため変更可能性があります。 1. 素材のセットアップ 塩化ナトリウム 1.5 g、ペプトン、1.25 g、8.5 g を 500 mL の水で寒天を溶解して線虫成長メディア (NGM)18メディアの 500 mL を準備します。オートクレーブ滅菌 (121 ° C、15 PSI、20 分) 後、追加のコレステロール (5 mg/mL のエタノール)、0.5 mL 1 M MgSO4、1 M CaCl2と 1 M カリウム リン酸バッファー、pH 7.4 (108.3 g KH2PO4 12.5 mL 0.5 mL の 0.5 mL、K2HPO4、水 1 L に 35.6 g)。 1 N 島の 25 mL、漂白剤、4 mL と水の 71 mL を混合することによって、次亜塩素酸を準備します。このソリューションを新しくします。 KH2PO4の 3 g、6 g の Na2HPO4、塩化ナトリウム 5 g、MgSO4と 1 l の水の 1 M の 5 mL を混合することによって M9 バッファーを準備します。 129 0.02 M K2HPO4mL、KH2PO4, 871 mL、塩化ナトリウム 5.85 g を混ぜて18 S バッファーを準備します。 M9 と S バッファーをオートクレーブで滅菌します。 大腸菌 (OP 50 株) 20 mL ルリア スープ (LB) の夜通し文化を育てます。 1 mM の原液 10% エタノールで BPA を解散します。S バッファーで 0.1 μ M、0.5 μ M、1 μ M、5 μ M、10 μ M の後続の希釈液を作る。注: S 緩衝水溶液の希釈は大幅エタノールの濃度を低減します。たとえば、このプロトコル (10 μ M) に記載されている最高の BPA 濃度でエタノールの濃度は 0.1 %v/v。 2線虫養殖と同期。 100 mm の版 (約 25 mL/プレート) に NGM メディアを注ぐし、固めることができます。凝固させる為、一度一晩成長液体培養からエシェリヒア属大腸菌OP50 の 150 μ L を広めることでプレートをシードします。37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。 次の日は、1 cm 角のおおよそのスラブをチャンキングによる新しいプレートに N2 ワームを転送します。目に見える胚を含む栄養の十分な成熟した大人とプレートが作成されるまで、20 ° C で 3 日間の成長するワームを許可します。 同期、プレート間に 5 mL の M9 バッファーをピペッティングにより各プレートを洗います。滅菌 15 mL の円錐形遠心チューブに液体を転送します。注: 同期は大人のワームを殺すし、比較的同じ段階である胚を収集することです。 成虫の餌の緩やかなを取得するために室温で 4 分間 3,000 × g で遠心分離機します。 10 mL のピペットを使用すると、ペレットをそのまま残すために上澄みを慎重に取り外します。次亜塩素酸溶液 5 mL を加え、軽く混ぜます。 3,000 x g常温で 4 分間遠心します。 10 mL のピペットで上澄みを削除し、7 mL の M9 バッファーで洗浄します。この手順を 2 回繰り返します。 3. BPA にワームを公開します。 上記のステップ 2.7 から最後の洗浄後 M9 バッファーと卵の約 100 μ L を中断します。既に S バッファーで希釈した BPA の適切な濃度を含む 2 mL の microfuge の管に卵の約 50 μ L を転送します。チューブあたり BPA (0.0 μ M、0.1 μ M、0.5 μ M、1.0 μ M、5.0 μ M と 10 μ M) の正しい最終濃度を確保する S バッファーの量を調整します。表 1 は、これらの希釈液を作る方法の 1 つを示しています。 最終の BPA 濃度 BPA をストック (100 μ M) S バッファー 同期のワーム 0.1 Μ M 1 Μ L 949 Μ L 50 Μ L 0.5 Μ M 5 Μ L 945 Μ L 50 Μ L 1 Μ M 10 Μ L 940 Μ L 50 Μ L 5 Μ M 50 Μ L 900 Μ L 50 Μ L 10 Μ M 100 Μ L 850 Μ L 50 Μ L 表 1: 株式 BPA、S バッファーと我々 の研究に使用される必要な濃度を達成するために使用される同期のワーム。 シェーカーにチューブを置き、軽く振るシェーカー 25 rpm またはロッキング シェーカー傾斜 25/分で、20 ° C で 4 時間。 4 h 後チューブ ホルダーに管を配置し、解決するワームを許可します。 上澄みを廃棄し、ワームをシード プレート (エシェリヒア属大腸菌OP50 NGM 板) に転送します。1.5 で述べたように液体のエシェリヒア属大腸菌OP50 文化で 2.1 で述べたようにプレートをシードします。 20 ° C で 60 h の成長ワームを聞かせてください。汚染の毎日のプレートを確認します。汚染された NGM プレートは通常変色し、個々 のコロニーを伴います。過密の顕微鏡下でワームをチェックします。エシェリヒア属大腸菌OP50 芝生と小さなスポットで集中してワームの欠如を意味する過密。 4. 前方タッチ慣れアッセイ 新しいシードされていない NGM プレート火災滅菌 30 G プラチナ ワイヤを使用して大人のワームを選ぶ約 10 同期の若者を転送します。ワームのままにそれらを許可するように 5 分間妨げられていない新しいプレートに順応する時間。 慣れ応答木製の串やつまようじの端に付す眉毛を使用し、70% エタノールに浸漬して消毒します。きれいな糸くずティッシュで拭くし、エタノールを蒸発させ 1 分待ちます。頭 (咽頭の球根の前方) にワームをそっと触れる眉の毛を使用しています。10 を許可するタッチを繰り返して回復するワームを許可するために接触の間に s。 ワームはもはや後方移動するまで (10 秒刺激間隔を許可) をタッチし続けます。この時点で、ワームには刺激に慣れます。慣らすにワームに必要なタッチの数を記録します。 平均慣れテューキー事後テストが続く一方通行 ANOVA を使用して処理と未処理のコントロール率の違いを分析します。 5. ワームの多産の試金 個々 の L3 ワームをプラチナのピックを使用して新鮮でシード プレートに転送します。その 1 つだけのワームはプレートごとに配置されていることを確認します。注: 後 L3 幼虫ワームは L4 幼虫期と成人期に発展します。早くそれらを拾っては、カウントでは見逃されることを卵を既にレイアウトしていない彼らを確保しながら、個々 の動物の転送のために十分に大きいという点で便利です。 すべての 12-24 h の卵数をカウントします。カウント後に新しいプレートに親虫を転送します。ワームは、通常 5 日後、産卵を停止を繰り返して、20 ° C で培養したとき注: 平均すると、野生型ワームことができます最大 300 の卵を産むしたがって、毎日新しいプレートに親を転送するを防ぐ過密。 テューキー事後テストが続く一方通行 ANOVA を使用して処理と未処理のコントロールにより産卵数の平均の違いを分析します。