Rastreamento neuroanatômica retrógrado do frênico neurônios em ratos
Summary
Aqui, descrevemos um protocolo para identificar frênico neurônios em ratos após entrega intrapleural de fluoróforo conjugado beta de subunidade de toxina de cólera. Duas técnicas são comparadas para injetar a cavidade pleural: transdiaphragmatic versus transtorácicos abordagens.
Abstract
Frênico neurônios motores são cervicais neurônios motores provenientes de C3 a C6 níveis em espécies de mamíferos mais. Axonal projeções convergem em nervos frênico que inervam o diafragma respiratório. Em fatias de medula espinhal, neurônios frênico não pode ser identificados de outros neurônios motores em critérios morfológicos ou bioquímicos. Nós fornecemos a descrição dos procedimentos para a visualização do neurônio motor frênico corpos celulares em camundongos, seguir intrapleural injeções de beta cólera toxina subunidade (CTB) conjugada com um fluoróforo. Este marcador fluorescente neuroanatômica tem a capacidade de ser pego na junção neuromuscular de diafragma, efectuar-se retrogradely ao longo dos axônios frênico e alcançar os frênico corpos celulares. Duas abordagens metodológicas da entrega CTB intrapleural são comparadas: transdiaphragmatic versus transtorácicos injeções. Ambas as abordagens são bem sucedidas e resultam em número semelhante de CTB-rotulado frênico neurônios motores. Em conclusão, essas técnicas podem ser aplicadas para visualizar ou quantificar os neurônios motores frênico em vários estudos experimentais tais como aqueles focados no circuito frênico-diafragma.
Introduction
O objetivo do estudo é apresentar um método confiável para identificar os neurônios motores frênico (PhMN) em seções de rato da medula espinhal. Injeção de um traçador fluorescente neuroanatômica na cavidade pleural foi escolhida como o método de entrega para alcançar as projeções frênica neuromusculares sobre o diafragma e usar o transporte retrógrado ao longo dos axônios frênico para rótulo frênico corpos celulares. Duas técnicas de entrega intrapleural são descritas: transdiaphragmatic versus transtorácica.
Frênico neurônios são células de relé espinhal cujos axônios convergem em nervos frênico, que em última análise, inervam o diafragma. Estes são os neurônios motores inferiores recebendo o drive inspiratório do centro respiratório bulbar e retransmitindo-as junções de diafragma neuro-muscular (JNM). PhMN estão estruturados em duas colunas de motor, uma para cada hemicord, correndo ao longo da espinha meados-cervical. Na maioria das espécies mamíferas, incluindo os seres humanos, as colunas de motor frênica espalhar de níveis C3 a C61,2,3. Nós e os outros confirmaram que PhMN concentrada nos níveis C3-C5 no rato e o rato da medula espinhal4,5,6,7,8. A distribuição topográfica das células frênica não é ao acaso; os neurônios motores que inervam a parte esternal do diafragma são mais densamente distribuídos na parte cranial da frota de veículos frênica (C3), Considerando que os neurônios motores que inervam a parte crural são mais caudal (C5)9. Além disso, PhMN estão agrupadas vària no Corno ventral cinzenta. A nível de C3, os clusters de células frênico minto lateralmente, então eles se deslocar em uma direção ventrolateral e encontram-se ventromedially com a mais caudal níveis10,11.
Dado o seu papel vital durante a inspiração, é de extrema importância para identificar com precisão a PhMN na medula espinhal saudável mas também seguir seu destino durante condições patológicas, tais como doenças degenerativas ou lesões traumáticas da medula espinhal. Desde que PhMN não diferem morfologicamente outros neurônios motor cervicais, identificação de PhMN baseia-se na entrega alvo dos marcadores neuroanatômica, tanto ao nível dos centros respiratórios primária8, ou diafragma MNJ7 ou em o nervo frênico4. O tracer é retomado pelas fibras nervosas e transportado até os frênico corpos celulares na coluna cervical, onde ele pode ser visualizado usando sistemas de deteção direta ou indireta. Retrógrada ou anterógrada traçadores são comercialmente disponíveis com uma ampla gama de conjugados. Notável, cada marcador é dotado não, baixas ou altas habilidades para rastreamento sináptica trans.
No estudo atual, nós escolhemos a subunidade beta a toxina da cólera (CTB) acrescida com Alexa Fluor 555 (doravante referido como CTB-fluoróforo) como uma etiqueta fluorescente, permitindo uma visualização directa de PhMN em seções congeladas da medula espinhal. CTB normalmente é descrito como um tracer monosynaptic embora dados experimentais tendem a mostrar uma passagem de transneuronal12. CTB tem a capacidade de vincular o gangliosídeo GM1 na membrana plasmática do fim do nervo. CTB é internalizada através de Clatrina dependente ou – independente mecanismos e tráfegos através da rede trans-Golgi em retículo endoplasmático em uma moda retrógrada13,14. A internalização e o transporte retrógrado parecem ser dependente sobre o citoesqueleto de actina15,16 , bem como sobre a rede de microtúbulos17.
Para demonstrar a utilidade do CTB como um traçador neuroanatômica retrógrada rotulagem diafragma-PhMN circuitos, CTB-fluoróforo foi entregue intrapleurally. CTB foi administrado usando duas técnicas: a primeira que incluía uma laparotomia e múltiplas injecções de transdiaphragmatic; o segundo, menos invasiva, usado uma única injeção transtorácica. Quatro dias mais tarde, fluorescente-etiquetadas PhMNs foram quantificados na medula espinhal cervical de ambos de saudável e de feridas spinally (C4) animais.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito neste documento pode ser aplicado a qualquer tipo de ratos adultos ou qualquer paradigma experimental em que a integridade do diafragma-PhMN circuito deve ser avaliada. Por exemplo, a esclerose lateral amiotrófica (ela) e lesão medular cervical (cSCI) são condições associadas com perda de PhMN, anterógrada degeneração dos axônios frênico e subsequente compromisso respiratório. Modelos animais de ALS ou cSCI imitam histopatológicos e funcionais respiratórios déficits observados em doenç…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nós estamos gratos ao Robert Graffin e Pauline Duhant pelo apoio técnico.
Materials
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
Referências
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