Изоляция, культура и дифференцировки клеток стромы костного мозга и остеокластов прародителей от мышей
Summary
В этой статье мы представляем методы изоляции и дифференцировать стромальных клеток костного мозга и стволовых гемопоэтических клеток от мыши длинных костей. Две различные протоколы представлены приносит различных клеточных популяций, пригодных для расширения и дифференцировку в остеобластов, адипоциты и остеокласты.
Abstract
Клетки стромы костного мозга (BMSCs) являются популяции клеток, обычно используется как представление мезенхимальных стволовых клеток в пробирке. Они находятся внутри полости костного наряду с гемопоэтических стволовых клеток (СКК), которые могут породить красные кровяные клетки, иммунных прародителями и остеокласты. Таким образом экстракции популяции клеток из костного мозга результатов в весьма разнородный набор различных клеточных популяций, которые могут представлять вызовы в экспериментальный дизайн и смешаем интерпретации данных. Несколько изоляции и культуры методы были разработаны в лабораториях для того чтобы получить более или менее однородной популяции BMSCs и СКК Инвитро. Здесь мы представляем два метода для изоляции BMSCs и СКК от мыши длинных костей: один метод, который дает смешанное население BMSCs и СКК и один метод, который пытается разделить два клеточных популяций на основе соблюдения. Оба метода предоставляют клетки для Остеогенные и адипогенном дифференциация экспериментов, а также функциональные анализы.
Introduction
Основная мышиных BMSCs обычно используются как модель в vitro мезенхимальных стволовых клеток с момента их открытия в начале 1980-х1. Действительно культуры клеток пластик сторонник, покраснел от полости костного длинных костей поддерживать способность быть продифференцированным в остеобластов, остеокласты, хрящевые клетки или адипоцитов многих исследований в2,3, 4 , 5. Однако, костного мозга является уникальная ткань состоит из многих различных клеточных популяций, включая, но не ограничиваясь, BMSCs, СКК, эндотелия и иммунные клетки. Таким образом изоляции и культуры методы могут принести клеточных популяций с различными однородности. Использование таких методов для проверки потенциальных дифференциации от клеток может быть сложным. Например при сравнении клетки от мышей с различными генотипами, начиная с населением смешанного клеток ограничивает интерпретации данных. И наоборот, получение однородной популяции BMSCs и СКК может быть технически сложным и не может быть как представитель модели ex vivo .
В нашей лаборатории мы в первую очередь заинтересованы в использовании BMSCs из-за их потенциал быть продифференцированным остеобластов, остеокластов и адипоцитов. Здесь мы представляем методов изоляции BMSCs и СКК и культуры, используемые для оценки osteoblastogenesis или adipogenesis в vitro, а также культур СКК дифференцироваться в остеокластов. Один метод использует смешанное население клеток костного мозга (BMC), содержащие BMSCs и СКК непосредственно подходит для adipogenesis, osteoblastogenesis и osteoclastogenesis (так называемый общий BMC). Этот метод является ex vivo представление ближе гетерогенности среди клеток костного мозга микроокружения. Другой метод отделяет приверженца от non сторонник клеток в попытке «чище» населения культуры BMSCs и СКК (называемых приверженцев BMSCs). Более поздних метод позволяет культуры клеток экспериментов, чтобы начать с более точное количество BMSCs или СКК и уменьшает потенциал комплекса косвенные эффекты других клеточных популяций, которые остаются в культуре. Оба метода были ранее опубликованы и используется для решения различных исследовательских вопросов6,,78,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье представлены два метода культуры BMSCs с их преимущества и ограничения. Изоляции клеток из костного мозга является относительно легким процессом. Однако получение популяции клеток, представитель мезенхимальных стволовых клеток или osteoclastic прародителями может быть сложным …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения (R01 AR061164-01A1).
Materials
| 200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
| 1.5mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
| 50mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
| Dissection tools | |||
| 70μm filters | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer inverter microscope | Zeiss |
Referências
- Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
- Chen, T. L. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone. 35 (1), 83-95 (2004).
- Kokabu, S., et al. BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b. Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).
- Ghali, O., et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation. BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).
- Kretlow, J. D., et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells. BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).
- DeMambro, V. E., et al. Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss. Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).
- Maridas, D. E., et al. IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner. J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).
- Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
- Abdallah, B. M., et al. CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells. Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).
- Akiyama, K., et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension. Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).
- Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?. Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).
