Isolatie, cultuur en differentiatie van beenmerg stromale cellen en Osteoclast voorlopercellen van muizen
Summary
In dit artikel presenteren we methoden om te isoleren en te onderscheiden van het beenmerg stromale cellen en hematopoietische stamcellen van lange beenderen van de muis. Twee verschillende protocollen worden gepresenteerd opbrengst andere cel populaties geschikt voor uitbreiding en differentiatie in botcellen, adipocytes en osteoclasten.
Abstract
Het beenmerg stromale cellen (BMSCs) vormen een celpopulatie routinematig gebruikt als een vertegenwoordiging van mesenchymale stamcellen in vitro. Ze bevinden zich in de holte van het beenmerg naast hematopoietische stamcellen (HSCs), die aanleiding tot rode bloedcellen, immuun progenitoren en osteoclasten geven kunnen. Dus, extracties van cel populaties uit de resultaten van de beenmerg in een zeer heterogene mix van diverse cel populaties, die kan uitdagingen aanwezig in experimenteel design en data interpretatie beschamen. Diverse isolatie en cultuur technieken zijn ontwikkeld in laboratoria met het oog op een min of meer homogene bevolking van BMSCs en HSCs invitro. Hier presenteren we twee methoden voor het isoleren van BMSCs en HSCs van lange beenderen van de muis: een methode die resulteert in een gemengde bevolking van BMSCs en HSCs en één methode die probeert te scheiden van de twee cel populaties gebaseerd op naleving. Beide methoden worden verkregen cellen geschikt voor osteogenic en adipogenic differentiatie experimenten zo goed als functionele testen.
Introduction
Primaire lymfkliertest BMSCs worden vaak gebruikt als een in vitro model van mesenchymale stamcellen sinds hun ontdekking in de vroege jaren 19801. Inderdaad, culturen van kunststof-aanhanger cellen uit het beenmerg holte van lange beenderen gespoeld handhaven de capaciteit te differentiëren in botcellen, osteoclasten, chondrocyten of adipocytes in vele studies2,3, 4 , 5. het beenmerg is echter een unieke weefsel bestaat uit veel verschillende cel populaties, inclusief, maar niet beperkt tot, BMSCs, HSCs, endotheel en immuun cellen. Dus, isolatie en cultuur technieken kunnen opleveren cel populaties met verschillende homogeniteit. Met behulp van deze technieken voor het testen van de mogelijke differentiatie van cellen kan worden uitdagende. Bijvoorbeeld, bij het vergelijken van cellen uit muizen met verschillende genotypen, beginnend met een gemengde celpopulatie beperkt de interpretatie van de gegevens. Omgekeerd, verkrijgen van homogene bevolking van BMSCs en HSCs kan technisch moeilijk en mogelijk niet als vertegenwoordiger van een ex vivo -model.
In ons laboratorium zijn we voornamelijk geïnteresseerd in het gebruik van BMSCs als gevolg van hun potentieel te differentiëren in botcellen, osteoclasten en adipocytes. Hier presenteren we technieken van BMSCs en HSCs isolement en cultuur gebruikt om te beoordelen osteoblastogenesis of adipogenesis in vitro, evenals de culturen van HSCs te onderscheiden in de osteoclasten. Één methode gebruikt een gemengde bevolking van beenmergcellen (BMCs) met BMSCs en HSCs direct geschikt voor adipogenesis, osteoblastogenesis, en osteoclastogenesis (totale BMCs genoemd). Deze methode is een nauwere ex vivo representatie van de heterogeniteit gevonden onder de cellen van het beenmerg-communicatie. Een andere methode scheidt aanhanger uit niet-aanhanger cellen in een poging aan cultuur “zuiverder” bevolking van BMSCs en HSCs (aanhanger BMSCs genoemd). De latere methode kan de celcultuur experimenten om te starten met een meer nauwkeurige aantal BMSCs of HSCs en vermindert het potentieel van complexe indirecte effecten van andere cel populaties die in de cultuur blijven. Beide methoden zijn eerder gepubliceerd en gebruikt om verschillende onderzoek vragen6,7,8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel worden twee methoden van cultuur van de BMSCs gepresenteerd met hun voordelen en beperkingen. Isoleren van cellen uit het beenmerg is een relatief eenvoudig proces. Verkrijgen van een vertegenwoordiger van de mesenchymale stamcellen of osteoclastic progenitoren celpopulatie kan echter uitdagende als gevolg van de verschillende cellulaire omgeving van de holte van het beenmerg.
Kweken van het geheel van de inhoud van het beenmerg biedt een nauwe weergave van de communicatie i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1).
Materials
| 200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
| 1.5mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
| 50mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
| Dissection tools | |||
| 70μm filters | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer inverter microscope | Zeiss |
Referências
- Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
- Chen, T. L. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone. 35 (1), 83-95 (2004).
- Kokabu, S., et al. BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b. Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).
- Ghali, O., et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation. BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).
- Kretlow, J. D., et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells. BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).
- DeMambro, V. E., et al. Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss. Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).
- Maridas, D. E., et al. IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner. J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).
- Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
- Abdallah, B. M., et al. CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells. Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).
- Akiyama, K., et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension. Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).
- Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?. Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).
