في هذه المقالة، نقدم طرق لعزل والتفريق بين الخلايا اللحمية في النخاع العظمى والخلايا الجذعية المكونة للدم من العظام الطويلة الماوس. وترد اثنين من البروتوكولات المختلفة الغلة السكان خلية مختلفة مناسبة للتوسع والتمايز في خلايا الاوستيوبلاستس و adipocytes والأكلة.
نخاع العظم stromal خلايا (بمسكس) يشكل عدد سكانها خلية تستخدم بشكل روتيني كتمثيل الخلايا الجذعية الوسيطة في المختبر. يقيمون داخل تجويف نخاع العظم جنبا إلى جنب مع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)، التي يمكن أن تؤدي إلى خلايا الدم الحمراء وفروعه محصنة والأكلة. وهكذا، عمليات استخراج سكان خلية من نتائج نخاع العظام في خليط غير متجانس جداً سكان الخلية المختلفة، التي يمكن أن تشكل تحديات في التصميم التجريبي وارباك تفسير البيانات. وضعت عدة العزلة وتقنيات الثقافة في المختبرات من أجل الحصول على السكان متجانسة أكثر أو أقل من بمسكس وهسكس invitro. هنا، نحن نقدم طريقتين لعزل بمسكس وهسكس من العظام الطويلة الماوس: أسلوب واحد التي تسفر عن عدد سكان مختلطة من بمسكس وهسكس وأسلوب واحد أن المحاولات الرامية إلى فصل السكان الخلية اثنين استناداً إلى الالتزام. توفر كلا أساليب مناسبة للخلايا أوستيوجينيك، والتمايز أديبوجينيك تجارب معبراً كذلك وظيفية.
بمسكس مورين الأولية تستخدم عادة كنموذج في المختبر للخلايا الجذعية الوسيطة منذ اكتشافهم في مطلع الثمانينات1. وفي الواقع، صون ثقافات خلايا البلاستيكية-تمسكا مسح من تجويف نخاع العظام الطويلة القدرة على تكون متباينة في adipocytes في العديد من الدراسات2،3، ، تشوندروسيتيس، خلايا الاوستيوبلاستس أو الآكلة 4 , 5-بيد أن نخاع العظم نسيج فريد يتألف من العديد من السكان خلية مختلفة بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، بمسكس، الخلايا البطانية، ومحصنة ضد هسكس،. وهكذا، العزلة وتقنيات الثقافة يمكن أن تسفر عن السكان خلية مع التجانس مختلفة. باستخدام هذه التقنيات لاختبار المفاضلة المحتملة من الخلايا يمكن أن يكون تحديا. على سبيل المثال، عند مقارنة الخلايا من الفئران مع الأنماط الجينية المختلفة، بدءاً خلايا مختلطة سكان حدود تفسير البيانات. على العكس من ذلك، الحصول على السكان متجانسة بمسكس وهسكس يمكن أن يكون صعباً من الناحية التقنية ولا يجوز كممثل من طراز السابقين فيفو .
في المختبر، نحن مهتمون أساسا في الاستفادة بمسكس بسبب قدرتها على أن تكون متمايزة إلى خلايا الاوستيوبلاستس والأكلة adipocytes. نقدم هنا، تقنيات العزل بمسكس وهسكس والثقافة المستخدمة لتقييم أوستيوبلاستوجينيسيس أو أديبوجينيسيس في المختبر، وكذلك الثقافات هسكس تفرق في الآكلة. يستخدم أسلوب واحد سكان مختلطة من “خلايا نخاع العظام” (بمكس) التي تحتوي على بمسكس وهسكس مباشرة مناسبة أديبوجينيسيس وأوستيوبلاستوجينيسيس وأوستيوكلاستوجينيسيس (تسمى بمكس المجموع). هذا الأسلوب توثيق السابقين فيفو تمثيل لعدم تجانس وجدت بين خلايا المكروية نخاع العظام. أسلوب آخر يفصل ملتصقة من الخلايا غير ملتصقة في محاولة لثقافة السكان “أنقى” بمسكس وهسكس (تسمى بمسكس ملتصقة). يسمح أسلوب لاحق ثقافة الخلية والتجارب للبدء بعدد أكثر دقة من بمسكس أو هسكس ويقلل من إمكانات مجمع الآثار غير المباشرة للسكان الخلية الأخرى التي ما زالت في الثقافة. نشرت كلا الأسلوبين سابقا وتستخدم لمعالجة مختلف البحوث الأسئلة6،7،،من89.
في هذه المقالة، يتم عرض طريقتين لثقافة بمسكس مع مزايا وقيود. عزل الخلايا من نخاع العظام وعملية سهل نسبيا. ومع ذلك، الحصول على عدد سكان خلية ممثل للخلايا الجذعية الوسيطة أو فروعه أوستيوكلاستيك يمكن أن تكون صعبة بسبب تنوع البيئة الخلوية تجويف نخاع.
استزراع مجمل محتويات نخاع ا…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل “المعاهد الوطنية للصحة” (R01 AR061164-01A1).
200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
1.5mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
15mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
50mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
Dissection tools | |||
70μm filters | BD Falcon | 352350 | |
0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
MEMα | Gibco | 12571 | |
Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
RANKL | Peprotech | 310-01 | |
mCSF | Peprotech | 315-02 | |
Axio Observer inverter microscope | Zeiss |