Визуализация биопленки в Candida albicans с помощью автоматизированных Microfluidic устройства
Summary
Этот протокол описывает использование настраиваемых автоматических microfluidic устройства визуализировать биопленки в Candida albicans физиологических условиях пребывания.
Abstract
Candida albicans является наиболее распространенным грибкового патогена людей, вызывая около 15% случаев внутрибольничных сепсиса. Основные вирулентности атрибут C. albicans является его способность формы биопленки, структурированные общины клеток, придает поверхности биотических и абиотических. C. albicans биоплёнки могут образовывать на хост тканей, таких как слои слизистой оболочки и медицинских устройств, таких как катетеры, кардиостимуляторов, протезы и совместного протезы. Биоплёнки ставят значительные клинические потому, что они обладают высокой устойчивостью к физическим и химическим возмущения и может выступать в качестве резервуаров для семян распространение инфекции. Различные анализы в vitro были использованы для изучения C. albicans биопленки, например микротитровальных пластина анализов, сухой вес измерений, анализов жизнеспособность клеток и сканирования Конфокальная лазерная микроскопия. Все эти анализы являются анализы одной конечной точки, где биопленки оценивается в конкретный момент. Здесь мы описываем протокол для изучения биопленки в режиме реального времени с помощью автоматизированных microfluidic устройства условиях ламинарного потока. Этот метод позволяет для наблюдения за биопленки как биопленки развивается с течением времени, используя настраиваемые условия, которые сходны принимающей таких возникающих в сосудистых катетеров. Этот протокол может использоваться для оценки дефектов биопленки генетических мутантов, а также тормозящее действие антимикробных агентов на развитие биопленки в режиме реального времени.
Introduction
Candida albicans является членом синантропных человека микробиоты, однако это также оппортунистических патогенов, способных привести к поверхностным и тяжелой грибковой инфекции1,2. Основные вирулентности черта C. albicans является его способность формы эластичного и лекарственно биопленки, общины клеток присоединились к поверхности и заключены в внеклеточного матрикса материала1,3. C. albicans биоплёнки хорошо структурированный, содержащих несколько слоев из нескольких типов клеток (раунд многообещающий дрожжей формы клетки, овальные pseudohyphal клеток и трубчатых клетки ГИФ)4. C. albicans биопленки развития начинается именно с соблюдения раунда дрожжей форма клеток на поверхности (посев биопленки), следуют распространения этих клеток на поверхности, и затем созревания незрелых биопленки структуры в полностью сформирована биопленки, которая окружена внеклеточной матрицы материалов4. Зрелые биопленки преимущественно состоит из удлиненных гиф клеток, которые образуют плотные и смежные сети, обеспечивая архитектурных стабильность биопленки4. На протяжении всего жизненного цикла биопленки раунд многообещающий дрожжи клетки расходятся от зрелых биопленки и могут путешествовать в другие регионы тела, чтобы вызвать распространение инфекции или семян новых биопленки на других сайтах4,5. C. albicans может формировать биоплёнки на биотические поверхностях, таких как слизистой поверхности и во всей ткани макроорганизма и на абиотические поверхностях, таких как катетеры, кардиостимуляторов, протезы и протезирование суставов. Благодаря непокорных свойства биопленки они чрезвычайно трудно искоренить, и во многих случаях стратегия только эффективного лечения является удаление инфицированного устройства4. Таким образом важно расследовать биопленки в условиях, аналогичных тем, которые наблюдаются в клинических условиях.
Есть несколько критических в vivo животных моделей для изучения C. albicans биопленки формирования6,,78; Однако эти исследования может быть дорогостоящим, требует много времени и ограничивается количество штаммов и противомикробных препаратов, которые могут быть проверены в любой момент времени. В vitro биопленки, с другой стороны, позволяют для быстрой и высок объём оценки противогрибковые соединений и мутантных штаммов и гораздо более экономически эффективным и этические чем биопленки анализов осуществляется вне в животных моделей9, 10,11,12,,1314. Здесь мы описываем assay в пробирке , который мы разработали и оптимизированы, чтобы наблюдать биопленки височно под ламинарным потоком с помощью настраиваемых microfluidic устройства14,15. Assay позволяет для визуализации каждого этапа биопленки, включая первоначальный присоединение шаг, пролиферации клеток, биопленки созревания и дисперсия клеток. Assay полезен также визуализировать изменения морфологии клеток на протяжении развития биопленки.
Микротитровальных плиты, которые обычно используются в vitro биопленки анализов, при высокой пропускной способности, не предусматривают условий контролируемого потока. Традиционные Ламинарные системы позволяют для непрерывной оценки биопленки в условиях контролируемого потока, но они часто много времени и, как правило, имеют ограниченный динамический диапазон управления и пропускную способность. Microfluidic устройство использованы здесь преодолевает эти ограничения путем сочетания высокой пропускной способности пластины (содержащий 48 скважин) с встроенным ламинарные камеры и воспроизводимость, универсальные и настраиваемые.
Здесь мы описываем протокол для использования коммерчески доступных автоматизированных microfluidic устройства для оценке биопленки одичал тип C. albicans напрягаться, воздействие известных противогрибковые агента на развитие биопленки и биопленки формирование в двух мутантных штаммов (bcr1Δ/Δ и efg1 Δ/Δ), о которых сообщалось ранее иметь биопленки дефекты in vitro и in vivo16,,17–18. Описывается протокол может использоваться для проверить эффективность антимикробных агентов в подавлении биопленки в ходе разработки биопленки и для идентификации генов, необходимых для нормального биопленки развития путем проведения скрининга мутантов библиотек.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настраиваемые microfluidic биопленки assay описанных здесь позволяет для визуализации биопленки в режиме реального времени на уровне отдельной ячейки при контакте с фиксированной ставкой ламинарного потока и постоянной температуре. Она предоставляет мощные средства для изучения развития б?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим всех членов Нобиле лаборатории для полезной дискуссии по биопленки анализов. Это исследование было поддержано национальных институтов здравоохранения (НИЗ) Грант R21 AI125801 (C.J.N.). D.L.R. была поддержана докторских стипендий из университета Калифорнии институт Мексики и Соединенных Штатов Америки (UC-MEXUS) и y Consejo Nacional de науки Технология (КОНАСИТ).
Materials
| BioFlux 1000z | Fluxion | Automated microfluidic device for live cell analysis | |
| 48-well plate 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Microfluidic plate |
| Montage Software | Fluxion | Version 7.8.4.0 | Visualization analysis software |
| ImageJ Software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Yeast Extract | Criterion | C7341 | |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Nutrient Broth | Criterion | C6471 | |
| Difco D-Mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Amphotericin B | Corning | 30-003-CF | |
| Sterile Inoculating Loops | VWR | 30002-094 | |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Lens Paper | VWR | 52846-001 | |
| Microplate and Cuvette Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | |
| Shaking Incubator | Eppendorf | M12820004 |
Referências
- Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
- Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
- Fox, E. P., Nobile, C. J., Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. . Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. , 1-24 (2013).
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
- Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
- Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
- Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
- Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
- Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
- Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
- Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
- Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Baker, K. . At the bench: A laboratory navigator. 27, (2005).
