Visualisatie van Biofilm vorming in Candida albicans met behulp van een geautomatiseerd Microfluidic-apparaat

Candida albicans is een commensale lid van de menselijke microbiota, maar het is ook een opportunistisch pathogeen, kan veroorzaken oppervlakkig en ernstige schimmelinfecties^1,2. Een kenmerk van de grote virulentie van C. albicans is haar vermogen om vorm veerkrachtig en resistente biofilms, Gemeenschappen van cellen vastgehouden aan een oppervlak en omsloten door een extracellulaire matrix materiële^1,3. C. albicans biofilms zijn zeer gestructureerd, met verschillende lagen van meerdere celtypen (ronde ontluikende gist-formulier cellen, ovale pseudohyphal cellen en tubulaire hyphal cellen)⁴. C. albicans biofilm ontwikkeling begint met de hechting van de cellen van de ronde gist-vorm op een oppervlak (zaaien de biofilm), gevolgd door de verspreiding van deze cellen op het oppervlak, en vervolgens de rijping van de onrijpe biofilm structureert in een volledig gevormde biofilm die is omgeven door extracellulaire matrix materiële⁴. De volwassen biofilm is voornamelijk samengesteld uit langgerekte hyphal cellen die dichte en onderling verbonden netwerken vormen, die de architecturale stabiliteit met de biofilm⁴. Gedurende de hele levenscyclus van biofilm, ronde ontluikende gist cellen verspreiden van de volwassen biofilm, en kunnen reizen naar andere regio’s van het lichaam veroorzaken gedissemineerde infecties of zaad nieuwe biofilms op andere sites^4,5. C. albicans kan biofilms vormen op biotische oppervlakken, zoals mucosal oppervlakken en in de gehele weefsel van de gastheer, en op abiotische oppervlakken, zoals katheters, pacemakers, kunstgebitten en prothetische gewrichten. Als gevolg van de weerspannige eigenschappen van biofilms, ze zijn uiterst moeilijk uit te roeien, en in veel gevallen is de enige effectieve behandeling strategie verwijderen van de geïnfecteerde apparaat⁴. Het is dus van cruciaal belang voor het onderzoeken van biofilm vorming onder omstandigheden die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in klinische instellingen.

Er zijn verschillende kritische in vivo dierlijke modellen gebruikt bij het bestuderen van C. albicans biofilm vorming^6,7,8; echter, deze studies kunnen worden duur, tijdrovend, en worden beperkt door het aantal stammen en antimicrobiële stoffen die kunnen worden getest op een bepaald moment. In vitro biofilm testen, aan de andere kant, toestaan voor de beoordeling van het snelle, hoge-doorvoer van antischimmel verbindingen en gemuteerde stammen, en zijn veel meer kosteneffectief en ethische dan biofilm testen uitgevoerd out in dierlijke modellen^{9, 10,11,12,13,14}. Hier beschrijven we een in vitro assay die we ontwikkeld en geoptimaliseerd voor het observeren van biofilm vorming stoffelijk onder laminaire stroom met behulp van een aanpasbare microfluidic apparaat^14,15. De bepaling voorziet in de visualisatie van elke fase van de vorming van de biofilm, met inbegrip van de naleving van de eerste stap, celproliferatie biofilm rijping en spreiding van de cel. De bepaling is ook handig om te visualiseren cel morfologie wijzigingen in de gehele ontwikkeling van een biofilm.

Microtiterplaat platen, die meestal worden gebruikt voor in vitro biofilm testen, terwijl de hoge doorvoer, toegestaan niet voor gecontroleerde stromingscondities. Traditionele laminaire flow cel systemen voor de continue beoordeling van biofilm vorming in gecontroleerde stromingscondities toestaan, maar deze zijn vaak tijdrovend te zetten en hebben de neiging te hebben beperkt dynamisch bereik controle en doorvoer. Het microfluidic-apparaat gebruikt hier overwint deze beperkingen door een combinatie van hoge-doorvoer platen (met 48 putten) met een ingebouwde laminaire flow kamer en zeer reproduceerbaar, veelzijdig en aanpasbaar.

Hier beschrijven we een protocol voor het gebruik van een commercieel beschikbare geautomatiseerde microfluidic apparaat te beoordelen van biofilm vorming van een wild-type C. albicans stam, de gevolgen van een bekende antimycoticum voor de ontwikkeling van een biofilm, en de biofilm vorming in twee gemuteerde stammen (bcr1Δ/Δ en efg1 Δ/Δ), die eerder werden gemeld dat biofilm gebreken in vitro pt in vivo^16,17,18. De beschreven protocol kan worden gebruikt voor het testen van de werkzaamheid van antimicrobiële stoffen in de remming van biofilm vorming in de gehele ontwikkeling van een biofilm, en om genen nodig zijn voor normale biofilm ontwikkeling door screening mutant bibliotheken te identificeren.