Durante la spermatogenesi, grandi onde semisincrona meiotiche delle cellule di germe sono rapidamente e continuamente rifornite nel testicolo all’inizio della pubertà e durante l’età adulta¹. In contrasto con i maschi, meiosi nelle femmine sono avviato esclusivamente durante lo sviluppo fetale. Dopo la nascita, gli ovociti rimangono arrestati in una fase prolungata dictyate di Profase I con un’intatto della vescicola germinale (GV; involucro nucleare) fino alla pubertà. Al momento della comparsa della pubertà, un sottoinsieme degli ovociti vengono selezionati ciclicamente a subire la crescita e la maturazione, segnando l’inizio della ripresa meiotica. Meiotica ripresa negli ovociti adulti si manifesta con la scomparsa del GV in un processo noto come rottura della vescicola germinale (GVBD). L’ovocita subisce quindi condensazione cromosomica e segregazione, seguita da estrusione corpo polare. Ovociti diventano arrestati sulla progressione di MII e sono stimolati per completare la divisione meiotica seconda e definitiva solo dopo la fecondazione.

Fertilità femminile è altamente dipendente dal successo della Profase Meiotica I progressione. Chiave di questo è la formazione di un collegamento fisico tra cromosomi omologhi, conosciuto come i chiasme, che è mediata dalla riparazione dell’indotto del DNA doppio filo (DSBs) tramite crossover ricombinazione². Questo processo si verifica nel contesto di un’impalcatura proteico dinamico conosciuto come il complesso Sinaptonemale (SC) che si forma tra cromosomi omologhi per facilitare loro synapsis³. Lo SC è una struttura tripartita della chiusura lampo-come costituito da due elementi laterali paralleli collegati da proteine regione centrale che tiene gli omologhi insieme durante la riparazione del DNA in corso. Prima sinapsi, precursori degli elementi laterali, chiamati elementi assiali, formano tra la sorella cromatidi. Complesso Sinaptonemale proteine quali SYCP2 e SYCP3 formano elementi assiali che colocalize agli assi sorella-cromatidio coesione durante la profase precoce. Successivamente i servire come siti per la proteina del filamento trasversale, SYCP1, che facilita il montaggio di elemento centrale e sinapsi tra omologhi allineati⁴di legame. Nei oocytes del mouse, synapsis completa è indicata dalla presenza di 20 completamente sovrapposti tratti SYCP3 e SYCP1, che possono essere visualizzati utilizzando cromatina diffondere preparazioni. Synapsis è completato con l’entrata in sotto il tavolino di pachitene, per cui maturo crossover che sono destinati a chiasmata forma tra omologhi sono decorate con mutL dimeri di omologo (MLH1/3) per promuovere la loro accurata lavorazione^{5,6 , 7}. la manutenzione strutturale dei complessi di cromosomi (SMC), tra cui coesina, condensin e il SMC5/6 complessi, sono importanti per la regolazione della dinamica di cromosoma e struttura durante meiosi^{8,9, 10,11,12}. Collettivamente, questi eventi garantiscono bi-orientamento corretto di cromosomi omologhi a opposte pali dell’alberino dopo smontaggio della SC.

Il ciclo cellulare meiotico è un potente modello per esaminare i ruoli delle varie proteine in manutenzione di genoma a causa dell’induzione programmata e la successiva riparazione di DNA DSBs. Inoltre, la meiosi dei mammiferi sono anche un modello rilevante per lo studio delle modificazioni epigenetiche e imprinting¹³. Tuttavia, è tecnicamente difficile valutare questi eventi durante la meiosi femminile, che si svolge nelle ovaie fetali e neonatali nei mammiferi (Figura 1). Profase I posso essere divisa in 5 sottostadi: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema e dictyate. Qui, descriviamo come isolare e distinguere tra fetale e neonatale ovaie e testicoli (Figura 2). Adattato da metodi precedentemente descritti, questo manoscritto delinea anche un protocollo (fase 1) con video dimostrativo per la preparazione di Profase Meiotica femmina ho cromatina si diffonde^14,15,16,17 . Quando accoppiato con immunolabelling, come descritto nei passaggi 6-7, questo protocollo consente analisi microscopica dettagliata della Profase I eventi negli ovociti.

Oogenesi sono soggetta a errori ed eventi malsegregazione cromosoma durante la prima divisione meiotica rappresentano la fonte più comune di malattia genetica nella progenie^18,19. In questo manoscritto (punto 2 del protocollo), descriviamo un protocollo in cui gli ovociti maturi in scena GV sono estratti da innescato ovaie di topi femminili adulti. In condizioni favorevoli, ovociti adulti subiscono luteinizing ormone-indipendente ripresa della meiosi seguendo l’isolamento e la coltura²⁰. In seguito ripresa meiotica, ovociti progredire attraverso meiosi I, quindi arrestano in metafase II. Gli ovociti rimangono arrestati in metafase II, a meno che non fertilizzato. Nei passaggi 2-5, ci adattiamo protocolli precedentemente segnalati con video dimostrativo per descrivere come raccogliere, cultura e preparare gli ovociti MI e MII per cromatina diffusa preparazioni²¹. Questa tecnica di diffusione di cromatina consente immunolabelling chiaro di proteine associate con i cromosomi. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato anche per distinguere tra cromosomi bivalenti e univalent e può ulteriormente risolvere single sorella cromatidi per facilitare la valutazione della ploidia degli ovociti. Pertanto, oltre a rivelare modelli di localizzazione delle proteine meiotiche, questo protocollo può anche servire come uno strumento prezioso per il delucidamento potenziali cause di malsegregazione cromosoma durante MI e MII.