Summary

Kromatin fare oosit ilerleme profaz metafaz II analizi için hazırlıklar yaymak

Published: February 26, 2018
doi:

Summary

Oogenesis memelilerde özellikle kromozom missegregation nedeniyle hataya, olduğu bilinmektedir. Bu el yazması için fare profaz, yaymak Kromatin hazırlama yöntemleri açıklar metafaz ı ve II sahnelenen yumurtalar. Bu temel teknikler Kromatin bağlı proteinler ve kromozom morfolojisi memeli oogenesis boyunca çalışma sağlar.

Abstract

Kromatin yayılmış teknikleri yaygın olarak gametogenesis, sperma için özellikle sırasında çeşitli proteinlerin yerelleştirme dinamik değerlendirmek için kullanılmaktadır. Bu teknikler izin homolog kromozom çifti, gibi segregasyonun olaylar sırasında protein ve DNA yerelleştirme desen canlandırma için synapsis ve DNA tamir. Birkaç protokolleri literatürde tarif var, genel Kromatin yayılmış teknikleri memeli profaz yumurta kullanarak sınırlı ve fetal yumurtalık mayoz inisiyasyon zamanlama nedeniyle zor vardır. Buna karşılık, profaz spermatocytes mikrodiseksiyon gerek kalmadan daha yüksek verimleri ile genç erkek fareler gelen toplanabilir. Ancak, hücre saf bir eşitlenmiş nüfusu nedeniyle çocuk ve yetişkin testis segregasyonun ve sonrası segregasyonun germ hücre popülasyonlarının heterojen belirli aşamalarında elde etmek zordur. Mayoz sonraki aşamalarını için yumurta geçiren mayoz ben (MI) veya mayoz II (MII), çünkü yetişkin dişi fareler toplanan ve mayoz kültür devam etmek için teşvik olgun yumurta grupları değerlendirmek için avantajlıdır. Burada, yumurta kullanarak segregasyonun Kromatin yaymak hazırlıkları için yöntemler üzerinden fetal, Yenidoğan disseke ve yetişkin yumurtalık video gösteriler eşlik ile açıklanmıştır. Kromozom missegregation memeli yumurta olaylarda özellikle MI sırasında sıktır. Bu teknikler değerlendirmek ve etkileri farklı mutasyon veya çevre Etkilenmeler oogenesis çeşitli aşamalarında tanımlamak için kullanılabilir. Oogenesis ve sperma arasında belirgin farklılıklar olduğundan, içinde açıklanan teknikleri memeli oogenesis anlayışımızı ve kromozom ve protein dinamiği cinsel dimorfik özellikleri mayoz sırasında artırmak için çok değerli .

Introduction

Sperma sırasında büyük yarı zaman uyumlu dalgalar segregasyonun germ hücrelerinin hızla ve sürekli olarak ergenlik ve yetişkinlik1boyunca başlangıçlı, testis içinde doldurulan vardır. Erkeklerin aksine, mayoz dişilerde fetal gelişim sırasında yalnızca başlatılır. Doğum yumurtalar profaz uzun süreli dictyate aşamasında tutuklanan kalır ben bir bozulmamış germinal vezikül (GV; nükleer zarf) ergenlik kadar ile. Ergenlik başlangıcında, yumurta kümesini cyclically seçilir büyüme ve olgunlaşma, segregasyonun yeniden başlamasını inisiyasyon işaretleme geçmesi. Köklerin yumurta içinde segregasyonun yeniden başlamasını GV germinal vezikül arıza (GVBD) bilinen bir işlemle ortadan kalkması ile kendini gösteriyor. Yumurta sonra kromozom yoğunlaşma ve segregasyon, kutup vücut ekstrüzyon tarafından takip uğrar. Yumurtalar MII ilerleme üzerine tutuklandı olmak ve döllenme sonra ikinci ve son segregasyonun bölümü tamamlamak için uyarılmış.

Kadın doğurganlık segregasyonun profaz başarısı üzerine son derece bağımlı ben ilerleme. Bu indüklenen DNA Çift Kişilik kırılmalara (DSBs) crossover rekombinasyon2bağlantısı tamiri tarafından aracılık ettiği chiasmata olarak bilinen homolog kromozomlar arasında fiziksel bir bağlantı oluşumunu anahtarıdır. Homolog kromozomlar arasında onların synapsis3kolaylaştırmak için formlar synaptonemal kompleksi (SC) olarak bilinen dinamik bir protein açısından zengin iskele bağlamında bu işlem gerçekleşir. SC homologs birlikte boyunca devam eden DNA tamiri tutan Merkez Bölge proteinler tarafından bağlı iki paralel yanal öğelerden oluşur bir fermuar gibi üçlü yapısıdır. Synapsis önce Aksiyel öğeler, adı yanal elemanlarının öncüleri arasında kardeş chromatids oluştururlar. Synaptonemal kompleks proteinlerin SYCP2 ve SYCP3 gibi kardeş Kromatit uyum eksenleri sırasında erken profaz colocalize eksenel öğeleri oluşturur. Daha sonra siteleri enine filaman protein, Merkezi öğesi derleme ve synapsis hizalanmış homologs4arasında kolaylaştırır SYCP1 için bağlayıcı olarak hizmet vermektedir. Fare yumurtalar tam synapsis 20 varlığı ile tamamen SYCP3 ve SYCP1 uzanıyor, Kromatin kullanarak görüntülenir üst üste hazırlıklar yaymak belirtilir. Synapsis sayede formu chiasmata homologs arasında mukadder olan olgun kesişim onların doğru işleme5,6 tanıtmak için mutL homolog (MLH1/3) dimer ile dekore edilmiş olup pachytene substage girdiği üzerine tamamlandı , 7. kromozom (SMC) kompleksleri, cohesin, condensin ve SMC5/6 karmaşık, dahil olmak üzere yapısal bakımından önemli kromozom dinamikleri ve yapısı mayoz8,9, boyunca düzenlenmesi için 10,11,12. Toplu olarak, bu olaylar uygun BI-yönünü homolog kromozomlar iğ Polonyalılar SC sökme takip karşıt sağlamak

Segregasyonun hücre döngüsü genom bakım programlanmış indüksiyon ve DNA DSBs sonraki onarım nedeniyle çeşitli proteinlerin rolleri incelemek için güçlü bir modeldir. Ayrıca, memeli mayoz Ayrıca, epigenetik değişiklikler ve basma13ilgili bir modelidir. Ancak, memeliler (şekil 1) fetal ve neonatal yumurtalıklarda yer alan kadın mayoz sırasında bu olayları değerlendirmek teknik olarak zordur. 5 substages ayrılabilir profaz: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema ve dictyate. Burada, biz ayırmak ve fetal ve neonatal yumurtalıklar ve testis (Şekil 2) arasındaki farkı anlatan. Önceden açıklanan yöntemleri uyarlanmış, bu el yazması da bir iletişim kuralı (Adım 1) kadın segregasyonun profaz hazırlanması için video gösterisi ile özetliyor ben Kromatin yayılır14,15,16,17 . 6-7, adımlarda açıklandığı gibi immunolabelling ile birleştiğinde bu protokolü profaz detaylı mikroskopik analiz sağlar ben yumurta olaylarda.

Oogenesis hata eğilimli olduğunu ve kromozom missegregation olaylar ilk segregasyonun bölünme sırasında döl18,19genetik hastalığın en yaygın kaynağı temsil eder. Bu makale (iletişim kuralı adım 2), biz olgun yumurta GV sahnelenen yetişkin dişi fareler astarlanmalıdır yumurtalıklar ayıkladığınız bir protokol tanımlamak. Destekleyici koşullar altında köklerin yumurta yalıtım ve kültür20takip mayoz Lüteinizan bağımsız yeniden başlamasını tabi. Segregasyonun yeniden başlamasını takiben yumurta mayoz ilerleme sonra metafaz II tutuklayın. Yumurta döllenmiş sürece. metafaz II, tutuklandı kalır Adımları 2-5, biz daha önce raporlanmış iletişim kuralları toplamak, kültür ve yaymak Kromatin hazırlıklar21için MI ve MII yumurta hazırlamak nasıl açıklamak için video gösterisi ile uyum. Teknik yayılan bu Kromatin kromozom ile ilişkili proteinlerin açık immunolabelling sağlar. Ayrıca, bu iletişim kuralını bivalent ve univalent kromozomlar arasında ayırt etmek için de kullanılabilir ve daha fazla tek kız kardeşi çözümlemek için yumurta Ploitlik değerlendirilmesi kolaylaştırmak için chromatids. Bu nedenle, yerelleştirme desenleri segregasyonun proteinlerin açığa yanı sıra, bu iletişim kuralını da kromozom missegregation MI ve MII sırasında olası nedenleri elucidating paha biçilmez bir araç olarak hizmet edebilir.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Johns Hopkins Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Vahşi tipli C57BL/6J fareler üzerinde deneyler yapıldı. 1. hasat Fetal veya Neonatal yumurtalık ve profaz Kromatin hazırlanması yayılır Post-coitum (dpc) embriyo 14,5-19,5 gün ayıklamak için servikal yerinden çıkması veya CO2 boğulma IACUC esaslarına göre hamile kadın kurban.Not: Doğum sonrası gün 1 – 5 y…

Representative Results

Görselleştirme ve yumurta segregasyonun kromozomlar değerlendirilmesi için iki teknik anlatmıştık. İlk teknik profaz ilerlemesinde embriyonik ve neonatal yumurtalıkların değerlendirilmesi doğru yiyecek ve içecek. Profaz Kromatin yayılmış ürünleri çok sayıda dinamik süreçler kromozom çifti, synapsis dahil olmak üzere, mayoz sırasında görüntülenmesi için son derece değerli ve desynapsis, homolog rekombinasyon ve epigenetik kromozom remodeling. Burada, bu yönt…

Discussion

Kromatin yayılmış hazırlıklar araştırmacılar dişi memeli mayoz ve proteinlerin dahil dinamik yerelleştirme kronolojik olarak çalışmaya izin verir. Embriyonik ve neonatal Kromatin yayılır segregasyonun profaz boyunca olayların yakın analiz için izin verir. Metafaz ben ve metafaz II Kromatin yayılır tek kız kardeşi fark için kullanılan chromatids gelen kız ve eşlenmiş homolog kromozomlar, Ploitlik değerlendirmek yanı sıra eşleştirilmiş. Buna karşılık, burada açıklanan Protokolü sık s…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser G.H. ve J.H. eğitim grant bursu üzerinden Ulusal Kanser Enstitüsü (NIH) (CA009110) ve NIGMS (R01GM11755) P.W.J için tarafından desteklenmiştir

Materials

10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 Quality Biological 119-069-161
60 mm x 15 mm petri dishes Denville T1106
35mm x 12mm petri dishes Denville T1103
Fine forceps VWR 300-050
Micro dissection scissors Ted Pella 1340
Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" VWR 82027-578
Watch glass square 1 5/8 Carolina Biological Supply Company 742300 Autoclave before each use
Sucrose Sigma S8501
Trisodium Citrate Dihydrate Sigma S1804
EDTA Sigma E6758
Trizma Base Sigma T1503
1,4-Dithiothreitol (DTT) Sigma 646563 Add to hypotonic buffer immediately before use
50x Protease Inhibitor Roche 11873580001 Add to hypotonic buffer immediately before use
Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) Becton, Dickinson (BD) 309623
Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) Thermo 3063-002
Super PAP pen, large (liquid blocker) Electron Microscopy Sciences (EMS) 71310
16% Paraformaldehyde aqueous Electron Microscopy Sciences (EMS) 15710
Triton X-100 Sigma T8787 Detergent in manuscript
Immuno stain moisture chamber Evergreen 240-9020-Z10
Coplin jars Fisher 08-815
Photo-flo 200 Electron Microscopy Sciences (EMS) 74257 Wetting agent in manuscript
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) Sigma G4877 Store aliquots at -20C
Human chorionic gonadotropin (HCG) Sigma C0434 Store aliquots at -20C
PYREX Spot Plates with nine concave cavities Fisher 13-748B Autoclave before each use
Glass capillary Fisher 22260943 For making oocyte collection needles
Brand Parafilm M Sigma BR701501 For making oocyte collection needles
Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) Fisher 14-178-5B For making oocyte collection needles
Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) Fisher 14-178-5D For making oocyte collection needles
Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing Sigma A5177-5EA For making oocyte collection needles
Mitutoyo micrometer head Mituoyo 150-208 For making oocyte collection needles
Syringe 5 mL BD Biosciences 309646 For making oocyte collection needles
Syringe filter 0.45 μm filter Corning 431220 For making oocyte collection needles
Glass Pasteur Pipette 5 3/4" Fisher 13-678-6A For making oocyte collection needles
83 x 0.5 mm pipette tip Denville P3080 For making oocyte collection needles
α-MEM Invitrogen 11415049
Waymouth's media Life Technologies 11220035
Fetal bovine serum Fisher A3160602
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A3311 For oocyte culture media
500ml filter units 0.22um Denville F5227
Hyaluronidase Sigma H3506
Tyrode’s solution Sigma T1788 Store aliquots at -20C
Horse serum Sigma H-1270 For ADB/wash buffer
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A1470 For ADB/wash buffer
VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI Vector Labs H-1200
Microscope cover slides (22mmx60mm) Fisher 12-544-G
Clear nail polish Amazon N/A
Name Company Catalog Number Comments
Microscopes
SteREO Discovery.V8 Zeiss 495015-0001-000
Observer Z1 Zeiss
Name Company Catalog Number Comments
Primary Antibodies
Mouse anti-MLH1 Life Technologies MA5-15431 Dilution factor- 1:100
Rabbit anti-SYCP1 Life Technologies PA1-16763 Dilution factor- 1:1000
Goat anti-SCP3 Santa Cruz sc-20845 Dilution factor- 1:50
Human anti-centromere protein Antibodies Incorporated 15-235 Dilution factor- 1:100
Rabbit anti- TOPOII Abcam ab109524 Dilution factor- 1:100
Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) Abcam ab78517 Dilution factor- 1:500
Rabbit anti-Rec8 Courtesy of Dr. Karen Schindler N/A Dilution factor- 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate Thermo-Fisher Scientific A-11057 Dilution factor- 1:500
Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate Thermo-Fisher Scientific A-21202 Dilution factor- 1:500
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate Thermo-Fisher Scientific A-31573 Dilution factor- 1:500
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate Thermo-Fisher Scientific A-11004 Dilution factor- 1:500
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo-Fisher Scientific A-11013 Dilution factor- 1:500
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate Thermo-Fisher Scientific A-11011 Dilution factor- 1:500

Referências

  1. Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
  2. Keeney, S. Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis. Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).
  3. Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).
  4. Vries, F. A., et al. Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation. Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).
  5. Baker, S. M., et al. Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).
  6. Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).
  7. Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).
  8. Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).
  9. Lee, J. Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis. J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).
  10. Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. W., Hamer, G. Resolving complex chromosome structures during meiosis: versatile deployment of Smc5/6. Chromosoma. 125 (1), 15-27 (2016).
  11. Hopkins, J., et al. Meiosis-specific cohesin component, Stag3 is essential for maintaining centromere chromatid cohesion, and required for DNA repair and synapsis between homologous chromosomes. PLoS Genet. 10 (7), e1004413 (2014).
  12. Hwang, G., et al. SMC5/6 is required for the formation of segregation-competent bivalent chromosomes during meiosis I in mouse oocytes. Development. 144 (9), 1648-1660 (2017).
  13. Kota, S. K., Feil, R. Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis. Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).
  14. Taketo, T. Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation. Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).
  15. Sun, X., Cohen, P. E. Studying recombination in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).
  16. Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).
  17. Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
  18. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  19. Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).
  20. Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
  21. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).
  22. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
check_url/pt/56736?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Hwang, G. H., Hopkins, J. L., Jordan, P. W. Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II. J. Vis. Exp. (132), e56736, doi:10.3791/56736 (2018).

View Video