क्रोमेटिन के लिए माउस Oocyte प्रगति के विश्लेषण के लिए प्रसार की तैयारी Metaphase द्वितीय के लिए चरण से
Summary
स्तनधारियों में Oogenesis के लिए त्रुटि प्रवण, विशेष रूप से गुणसूत्र अलगाव की वजह से जाना जाता है । इस पांडुलिपि का वर्णन क्रोमेटिन माउस चरण के लिए प्रसार तैयारी विधियों, metaphase मैं और द्वितीय मंचन अंडाणुओं । इन मौलिक तकनीक स्तनधारी oogenesis भर में क्रोमेटिन-बाउंड प्रोटीन और गुणसूत्र आकृति विज्ञान के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं ।
Abstract
क्रोमेटिन प्रसार तकनीक व्यापक रूप से gametogenesis के दौरान विभिन्न प्रोटीन के गतिशील स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, विशेष रूप से शुक्राणुजनन के लिए. इन तकनीकों जैसे मुताबिक़ गुणसूत्र बाँधना, synapsis और डीएनए की मरंमत के रूप में meiotic घटनाओं के दौरान प्रोटीन और डीएनए स्थानीयकरण पैटर्न के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं । जबकि साहित्य में कुछ प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, स्तनधारी दौर अंडाणुओं का उपयोग कर सामान्य क्रोमेटिन प्रसार तकनीक सीमित हैं और भ्रूण अंडाशय में अर्धसूत्रीविभाजन दीक्षा के समय के कारण मुश्किल. इसकी तुलना में, चरण spermatocytes microdissection के लिए आवश्यकता के बिना उच्च पैदावार के साथ किशोर पुरुष चूहों से एकत्र किया जा सकता है । तथापि, यह किशोर और वयस्क वृषण में meiotic और पोस्ट-meiotic रोगाणु कोशिका आबादी के विविधता के कारण विशिष्ट चरणों में कोशिकाओं की एक शुद्ध सिंक्रनाइज़ जनसंख्या प्राप्त करने के लिए मुश्किल है । अर्धसूत्रीविभाजन के बाद के चरणों के लिए, यह अर्धसूत्रीविभाजन मैं (MI) या अर्धसूत्रीविभाजन द्वितीय (मिि) अंडाणुओं दौर से गुजर के आकलन करने के लिए लाभप्रद है, क्योंकि परिपक्व अंडाणुओं के समूहों वयस्क मादा चूहों से एकत्र किया जा सकता है और संस्कृति में अर्धसूत्रीविभाजन फिर से शुरू करने के लिए उत्तेजित । यहां, भ्रूण, नवजात और वयस्क अंडाशय से विच्छेदित अंडाणुओं का उपयोग कर meiotic क्रोमेटिन प्रसार की तैयारी के लिए तरीके साथ वीडियो प्रदर्शनों के साथ वर्णित हैं । स्तनधारी अंडाणुओं गुणसूत्र अलगाव की घटनाओं में लगातार कर रहे हैं, विशेष रूप से मील के दौरान । इन तकनीकों का मूल्यांकन करने के लिए और oogenesis के विभिंन चरणों के दौरान विभिंन उत्परिवर्तनों या पर्यावरण जोखिम के प्रभाव को चिह्नित किया जा सकता है । के रूप में वहां oogenesis और शुक्राणुजनन के बीच अलग मतभेद हैं, तकनीकों के भीतर वर्णित स्तनधारी oogenesis और dimorphic के दौरान गुणसूत्र और प्रोटीन गतिशीलता के यौन अर्धसूत्रीविभाजन सुविधाओं की हमारी समझ को बढ़ाने के लिए अमूल्य हैं .
Introduction
शुक्राणुजनन के दौरान, बड़े अर्द्ध meiotic रोगाणु कोशिकाओं के तुल्यकालिक तरंगों तेजी से कर रहे है और लगातार यौवन की शुरुआत में वृषण में मंगाया और वयस्कता में1भर । पुरुषों के विपरीत, महिलाओं में अर्धसूत्रीविभाजन केवल भ्रूण के विकास के दौरान शुरू की है । जंम के बाद, अंडाणुओं एक लंबे समय तक dictyate मैं एक बरकरार कीटाणु पुटिका (जीवी; परमाणु लिफाफा) यौवन तक के साथ दौर में गिरफ्तार रहना । यौवन की शुरुआत में, अंडाणुओं का एक सबसेट चक्रीय रूप से विकास और परिपक्वता से गुजरना करने के लिए चयनित कर रहे हैं, meiotic बहाली की दीक्षा अंकन. पूरी तरह से विकसित अंडाणुओं में Meiotic बहाली एक कीटाणु पुटिका टूटने (GVBD) के रूप में जाना जाता प्रक्रिया में जीवी के लापता होने से प्रकट होता है । oocyte तो गुणसूत्र संघनित्र और अलगाव, ध्रुवीय शरीर बाहर निकालना द्वारा पीछा किया जाता है । अंडाणुओं प्रगति पर मिि के लिए गिरफ्तार हो जाते है और निषेचन के बाद ही दूसरी और अंतिम meiotic विभाजन को पूरा करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं ।
महिला प्रजनन meiotic दौर मैं प्रगति की सफलता पर अत्यधिक निर्भर है । इस के लिए कुंजी chiasmata के रूप में जाना मुताबिक़ गुणसूत्रों के बीच एक शारीरिक संबंध का गठन है, जो प्रेरित डीएनए की मरंमत द्वारा मध्यस्थता है डबल कतरा टूटता (DSBs) अंतरराष्ट्रीय पुनर्संयोजन के माध्यम से2। यह प्रक्रिया एक गतिशील प्रोटीन से भरपूर synaptonemal परिसर (अनुसूचित जाति) के रूप में जाना जाता पाड़ के संदर्भ में होता है कि मुताबिक़ गुणसूत्रों के बीच रूपों उनके synapsis3की सुविधा के लिए । अनुसूचित जाति एक ज़िप-की तरह त्रिपक्षीय संरचना है कि दो समानांतर पार्श्व मध्य क्षेत्र प्रोटीन है कि चल रहे डीएनए की मरंमत भर में एक साथ homologs धारण द्वारा जुड़े तत्वों के होते हैं । synapsis करने से पहले, पार्श्व तत्वों के अग्रदूत, अक्षीय तत्व कहा जाता है, बहन chromatids के बीच रूप । Synaptonemal जटिल प्रोटीन जैसे SYCP2 और SYCP3 फार्म अक्षीय तत्व है कि जल्दी दौर के दौरान बहन-chromatid सामंजस्य कुल्हाड़ियों को colocalize । ये बाद में अनुप्रस्थ रेशा प्रोटीन, SYCP1, जो केंद्रीय तत्व विधानसभा और गठबंधन homologs4के बीच synapsis की सुविधा के लिए बाध्यकारी साइटों के रूप में सेवा करते हैं । माउस अंडाणुओं में, पूर्ण synapsis 20 पूरी तरह अतिव्यापी SYCP3 और SYCP1 फैला है, जो क्रोमेटिन प्रसार की तैयारी का उपयोग करके visualized किया जा सकता है की उपस्थिति से संकेत दिया है । Synapsis pachytene उपचरण में प्रवेश पर पूरा हो गया है, जिससे परिपक्व क्रॉसओवर कि homologs के बीच chiasmata फार्म के लिए किस्मत में है mutL homolog (MLH1/dimers के साथ सजाया जाता है उनके सटीक प्रसंस्करण को बढ़ावा देने के लिए5,6 , 7. गुणसूत्रों के संरचनात्मक रखरखाव (एसएमसी) परिसरों, cohesin, condensin सहित, और SMC5/6 परिसर, गुणसूत्र गतिशीलता और संरचना के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है अर्धसूत्रीविभाजन8भर में,9, 10,11,12. सामूहिक रूप से, इन घटनाओं के मुताबिक़ गुणसूत्रों के उचित द्वि-उंमुखीकरण को अनुसूचित जाति के निंनलिखित धुरी डंडे का विरोध करने के लिए सुनिश्चित करते हैं ।
meiotic सेल साइकिल एक शक्तिशाली मॉडल के जीनोम में विभिन्न प्रोटीन की भूमिकाओं की जांच करने के लिए क्रमादेशित प्रेरण और बाद में डीएनए DSBs की मरंमत के कारण है । इसके अलावा, स्तनधारी अर्धसूत्रीविभाजन भी epigenetic संशोधनों के अध्ययन के लिए एक प्रासंगिक मॉडल और13अंकित है । हालांकि, यह महिला अर्धसूत्रीविभाजन, जो स्तनधारियों में भ्रूण और नवजात अंडाशय में जगह लेता है (चित्रा 1) के दौरान इन घटनाओं का आकलन करने के लिए तकनीकी रूप से मुश्किल है । leptonema, zygonema, pachynema, diplonema और dictyate: चरण मैं 5 उपस्तरों में विभाजित किया जा सकता है । इस के साथ साथ, हम वर्णन कैसे अलग करने के लिए और भ्रूण और नवजात अंडाशय और testes (चित्रा 2) के बीच भेद । पहले वर्णित विधियों से रूपांतरित, यह पांडुलिपि भी एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा (चरण 1) महिला meiotic की तैयारी के लिए वीडियो प्रदर्शन के साथ मैं क्रोमेटिन फैलता है14,15,16,17 . जब immunolabelling के साथ युग्मित, के रूप में 6-7 कदम में वर्णित है, इस प्रोटोकॉल की विस्तृत सूक्ष्म विश्लेषण में सक्षम बनाता है दौर मैं अंडाणुओं में घटनाओं ।
Oogenesis त्रुटि प्रवण है, और गुणसूत्र अलगाव की घटनाओं पहले meiotic विभाजन के दौरान18,19संतान में आनुवंशिक रोग का सबसे आम स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस पांडुलिपि (प्रोटोकॉल चरण 2) में, हम एक प्रोटोकॉल जिसमें परिपक्व जीवी-मंचन अंडाणुओं वयस्क मादा चूहों के प्रधानमंत्री अंडाशय से निकाले जाते है का वर्णन । सहायक शर्तों के तहत, पूरी तरह से बढ़ी अंडाणुओं luteinizing हार्मोन-अलगाव और संस्कृति के बाद अर्धसूत्रीविभाजन के स्वतंत्र बहाली से गुजरना20। meiotic बहाली के बाद, अंडाणुओं प्रगति अर्धसूत्रीविभाजन मैं, metaphase द्वितीय पर तो गिरफ्तारी के माध्यम से । अंडाणुओं metaphase द्वितीय में गिरफ्तार रहते हैं, जब तक निषेचित। चरण 2 – 5 में, हम पहले वीडियो प्रदर्शन के साथ रिपोर्ट प्रोटोकॉल अनुकूलित करने के लिए कैसे इकट्ठा करने के लिए का वर्णन करने के लिए, संस्कृति और क्रोमेटिन प्रसार की तैयारी के लिए MI और मिि अंडाणुओं तैयार21। इस क्रोमेटिन प्रसार तकनीक गुणसूत्रों के साथ जुड़े प्रोटीन की स्पष्ट immunolabelling के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल भी bivalent और univalent गुणसूत्रों के बीच अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और आगे oocyte ploidy के आकलन की सुविधा के लिए एकल बहन chromatids हल कर सकते हैं । इसलिए, meiotic प्रोटीन के स्थानीयकरण पैटर्न का खुलासा करने के अलावा, इस प्रोटोकॉल भी MI और मिि के दौरान गुणसूत्र अलगाव की elucidating संभावित कारणों के लिए एक अमूल्य उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
क्रोमेटिन प्रसार की तैयारी के लिए शोधकर्ताओं ने महिला स्तनधारी अर्धसूत्रीविभाजन और शामिल प्रोटीन के गतिशील स्थानीयकरण का अध्ययन करने की अनुमति । भ्रूण और नवजात क्रोमेटिन फैलता meiotic दौर भर में घटनाओं …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIGMS (R01GM11755) द्वारा पी. डब्ल्यू. जे. और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (NIH) (CA009110) से G.H. और J.H. को एक प्रशिक्षण अनुदान फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
| 60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
| 35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
| Fine forceps | VWR | 300-050 | |
| Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
| Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
| Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| 50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
| Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
| Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| 16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
| Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
| Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
| PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
| Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
| Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
| Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
| Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
| Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
| Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
| 83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
| α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
| Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
| 500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
| Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
| VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear nail polish | Amazon | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
| Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
| Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
| Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |
Referências
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Keeney, S. Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis. Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).
- Vries, F. A., et al. Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation. Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).
- Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).
- Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).
- Lee, J. Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis. J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).
- Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. W., Hamer, G. Resolving complex chromosome structures during meiosis: versatile deployment of Smc5/6. Chromosoma. 125 (1), 15-27 (2016).
- Hopkins, J., et al. Meiosis-specific cohesin component, Stag3 is essential for maintaining centromere chromatid cohesion, and required for DNA repair and synapsis between homologous chromosomes. PLoS Genet. 10 (7), e1004413 (2014).
- Hwang, G., et al. SMC5/6 is required for the formation of segregation-competent bivalent chromosomes during meiosis I in mouse oocytes. Development. 144 (9), 1648-1660 (2017).
- Kota, S. K., Feil, R. Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis. Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).
- Taketo, T. Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation. Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).
- Sun, X., Cohen, P. E. Studying recombination in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).
- Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).
- Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
