כרומטין להפיץ את ההכנות לניתוח של העכבר Oocyte התקדמות מן Prophase כדי מפה של השני
Summary
Oogenesis ביונקים ידוע להיות מועדת לטעויות, במיוחד עקב כרומוזום missegregation. כתב יד זה מתאר שיטות הכנה כרומטין להפיץ prophase העכבר, מפה של אני, oocytes ביים השני. טכניקות יסוד אלה מאפשרים לימוד חלבוני כרומטין מכורך כרומוזום מורפולוגיה ברחבי oogenesis יונקים.
Abstract
טכניקות התפשטות כרומטין היה בשימוש נרחב כדי להעריך לוקליזציה דינמי של חלבונים שונים במהלך gametogenesis, במיוחד עבור יצירת זרע. טכניקות אלה מאפשרות ויזואליזציה של חלבון ודפוסי לוקליזציה DNA במהלך אירועים meiotic כגון כרומוזום הומולוגי זיווג, synapsis, ה-DNA תיקון. בעוד כמה פרוטוקולים תוארו בספרות, כרומטין כללי התפשטות באמצעות oocytes prophase בתרבית של טכניקות הם מוגבלים וקשה בשל העיתוי של מיוזה חניכה של השחלות עוברית. לשם השוואה, ניתן לאסוף prophase spermatocytes של עכברים זכר לנוער עם תשואות גבוהות ללא צורך microdissection. עם זאת, קשה להשיג אוכלוסיה מסונכרן טהור של תאים בשלבים מסוימים עקב הטרוגניות של אוכלוסיות meiotic, פוסט-meiotic תא הנבט ב בזרמה לנוער ומבוגרים. בשלבים מאוחרים יותר של מיוזה, זה יתרון כדי להעריך oocytes עוברים מיוזה I (MI) או מיוזה II (MII), כי קבוצות של oocytes בוגר יכול להיות שנאסף עכברים נקבה בוגרת מגורה כדי לחדש את המיוזה בתרבות. . הנה, שיטות ההכנות כרומטין meiotic להתפשט באמצעות oocytes גזור מן העובר, neonatal, השחלות למבוגרים מתוארים בליווי הדגמות וידאו. כרומוזום missegregation םיעוריא oocytes יונקים הם בתדירות גבוהה, במיוחד במהלך MI. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי להעריך ולאפיין את ההשפעות של מוטציות שונות או חשיפות סביבתיות בשלבים שונים של oogenesis. שכן, ישנם הבדלים ברורים בין oogenesis לבין יצירת זרע מהטכניקות שתוארו בתוך הם לא יסולא בפז כדי להגדיל את ההבנה שלנו של יונקים oogenesis ותכונות dimorphic מינית של דינמיקה כרומוזום וחלבון במהלך המיוזה .
Introduction
במהלך יצירת זרע, סינכרונית למחצה גלי העלייה הגדולים של meiotic בתאי הנבט במהירות ובאופן רצוף מתחדשות ב בזרמה בתחילת גיל ההתבגרות וברחבי לבגרות1. בניגוד הזכרים, מיוזה אצל נקבות מאותחלת אך ורק במהלך התפתחות העובר. בעקבות הלידה, oocytes נשארים נעצר בשלב dictyate ממושך של prophase אני עם שלפוחית-germinal שלם (GV; מעטפת הגרעין) עד גיל ההתבגרות. מיד עם תחילת גיל ההתבגרות, תת-קבוצה של oocytes המזמורים נבחרים לעבור גדילה, התבגרות, סימון אתחול של חידוש meiotic. חידוש meiotic ב oocytes וחוה מתבטאת על ידי היעלמותו של GV בתהליך המכונה התמוטטות germinal שלפוחית (GVBD). Oocyte לציפוי כרומוזום עיבוי, סגרגציה, ואחריו הגוף קוטב ההבלטה. Oocytes הופכים נעצרה על סדר MII, מומרץ כדי להשלים את החטיבה השנייה והאחרונה meiotic רק לאחר ההפריה.
פוריות נשית תלויה מאוד להצלחת meiotic prophase אני התקדמות. המפתח לכל זה היא היווצרות-חיבור פיזי בין כרומוזומים הומולוגיים הידועה בשם chiasmata, אשר מתווך על ידי תיקון המושרה מעברי חוט כפול דנ א (DSBs) באמצעות כבל מוצלב רקומבינציה2. תהליך זה מתרחש בתוך ההקשר של לפיגום עשירים בחלבון דינאמית הידועה בשם המתחם synaptonemal (SC) המהווה בין כרומוזום הומולוגי כדי להקל על שלהם synapsis3. SC הוא דמוי רוכסן tripartite מבנה המורכב שני אלמנטים לרוחב מקבילים המחוברים באמצעות חלבונים באזור המרכז שמחזיק homologs יחד במהלך מתמשך DNA לתקן. לפני synapsis, מבשרי מרכיבי לרוחב, שנקרא אלמנטים צירית, יוצרים בין האחות chromatids. Synaptonemal קומפלקס חלבונים כגון SYCP2 ו- SYCP3 טופס צירית הגורמים colocalize בצירים לכידות כרומטידה אחות במהלך prophase המוקדמות. אלה מאוחר יותר לשמש מחייב אתרים עבור החלבון נימה רוחבי, SYCP1, אשר מאפשר הרכבה יסוד מרכזי, synapsis בין מיושר homologs4. ב oocytes העכבר, synapsis מלאה מסומן על ידי הנוכחות של 20 לגמרי חופפים מתיחות SYCP3 ו SYCP1, אשר ניתן לאבחן באמצעות כרומטין להפיץ את ההכנות. Synapsis הושלמה בעת כניסתו substage pachytene, לפיה ג’יי ג’יי אברהמס בוגרת זה נועדו טופס chiasmata בין homologs מעוטרים mutL הדימרים homolog (MLH1/3) כדי לקדם את עיבוד מדויק שלהם,5,6 , 7. קיום מתחמי כרומוזומים (SMC), כולל cohesin, condensin ו- SMC5/6 מתחם מבניים חשובים עבור הרגולציה של כרומוזום dynamics ומבנה במהלך המיוזה8,9, 10,11,12. באופן קולקטיבי, אירועים אלה להבטיח bi-כיוון נכון של כרומוזומים הומולוגיים מנוגדות הפולנים פלך בעקבות פירוק של SC.
מחזור התא meiotic הוא מודל חזק כדי לבחון את התפקידים של חלבונים שונים בתחזוקת הגנום עקב אינדוקציה מתוכנת תיקון עוקבות של דנ א DSBs. יתר על כן, בתרבית של המיוזה היא גם דוגמנית הרלוונטיים לצורך המחקר של שינויים epigenetic, החתמה13. עם זאת, מבחינה טכנית קשה להעריך אירועים אלה במהלך המיוזה הנשי, אשר מתקיים בעובר ו neonatal השחלות אצל יונקים (איור 1). Prophase אני יכול להיות מחולק 5 substages: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema ו- dictyate. במסמך זה, אנו מתארים כיצד לבודד, להבחין בין עוברי ו neonatal השחלות, האשכים (איור 2). הותאם מפעולות שתואר קודם לכן, כתב יד זה גם מתאר פרוטוקול (שלב 1) עם הפגנה וידאו להכנת prophase meiotic הנשי אני כרומטין מתפשט14,15,16,17 . בשילוב עם immunolabelling, כפי שמתואר שלבים 6-7, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מיקרוסקופי מפורט של prophase אני אירועים oocytes.
Oogenesis מועדת לשגיאות, כרומוזום missegregation אירועים במהלך החטיבה meiotic הראשון מייצג את המקור הנפוץ ביותר של מחלה גנטית רומא18,19. כתב יד זה (פרוטוקול שלב 2), נתאר פרוטוקול שבו oocytes ביים-GV בוגרת המחולצים להתקפת השחלות של עכברים הנשי למבוגרים. בתנאים תומכת, oocytes וחוה עוברים הורמון מחלמן תלויית חידוש מיוזה בעקבות בידוד ותרבות20. בעקבות חידוש meiotic, oocytes להתקדמות מיוזה, ואז לעצור-מפה של השני. Oocytes נשארים נעצר ב מפה של השני, אלא אם כן מופרית. שלבים 2-5, אנחנו להסתגל פרוטוקולים שדווחה בעבר עם הפגנה וידאו כדי לתאר כיצד לאסוף, תרבות ולהכין oocytes MI, MII כרומטין להפיץ את ההכנות21. זה כרומטין התפשטות הטכניקה מאפשר immunolabelling ברורה של חלבונים הקשורים כרומוזומים. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי להבדיל בין כרומוזום טרינארית ו univalent, ולא ניתן לפתור עוד אחות אחת chromatids כדי להקל על הערכה של oocyte פלואידיות. לכן, בנוסף חשיפת דפוסי לוקליזציה של חלבונים meiotic, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כלי רב ערך עבור שחקרתי סיבות פוטנציאליות של כרומוזום missegregation במהלך MI MII.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההכנות התפשטות כרומטין לאפשר לחוקרים ללמוד באופן כרונולוגי הנשי מיוזה יונקים ו לוקליזציה דינמי של חלבונים המעורבים. בכפולות כרומטין עובריים ו neonatal מאפשרים ניתוח קרוב של אירועים ברחבי meiotic prophase. מפה של מפה של השני ואני כרומטין כפולות יכול לשמש כדי להבחין בין האחות יחיד chromatids מ זיווג כרומו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIGMS (R01GM11755) כדי P.W.J על ידי מלגת גרנט אימונים מ הלאומי סרטן המכון (NIH) (CA009110) ג. ה, ג’יי-אייץ
Materials
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
| 60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
| 35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
| Fine forceps | VWR | 300-050 | |
| Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
| Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
| Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| 50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
| Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
| Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| 16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
| Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
| Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
| PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
| Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
| Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
| Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
| Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
| Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
| Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
| 83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
| α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
| Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
| 500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
| Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
| VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear nail polish | Amazon | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
| Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
| Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
| Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |
Referências
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Keeney, S. Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis. Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).
- Vries, F. A., et al. Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation. Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).
- Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).
- Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).
- Lee, J. Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis. J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).
- Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. W., Hamer, G. Resolving complex chromosome structures during meiosis: versatile deployment of Smc5/6. Chromosoma. 125 (1), 15-27 (2016).
- Hopkins, J., et al. Meiosis-specific cohesin component, Stag3 is essential for maintaining centromere chromatid cohesion, and required for DNA repair and synapsis between homologous chromosomes. PLoS Genet. 10 (7), e1004413 (2014).
- Hwang, G., et al. SMC5/6 is required for the formation of segregation-competent bivalent chromosomes during meiosis I in mouse oocytes. Development. 144 (9), 1648-1660 (2017).
- Kota, S. K., Feil, R. Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis. Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).
- Taketo, T. Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation. Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).
- Sun, X., Cohen, P. E. Studying recombination in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).
- Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).
- Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
