الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية لتحليل تطور البويضات الماوس من الطور الأول الطورية الثاني
Summary
تكون البويضات في الثدييات المعروف أن يكون عرضه للخطأ، لا سيما بسبب ميسيجريجيشن كروموسوم. توضح هذه المخطوطة الكروماتين انتشرت إعداد أساليب للماوس الطور الأول، الطورية الأول والثاني نظموا بويضات. تسمح هذه التقنيات الأساسية لدراسة البروتينات المرتبطة الكروماتين ومورفولوجيا كروموسوم طوال تكون البويضات الثديية.
Abstract
الكروماتين انتشار التقنيات قد استخدمت على نطاق واسع لتقييم التعريب الحيوي للبروتينات المختلفة خلال الجاميطات، خاصة بالنسبة للحيوانات المنوية. تسمح هذه التقنيات للتصور من البروتين والحمض النووي التعريب أنماط أثناء الأحداث هو مثل الكروموسوم مثلى الأقران، إصلاح تشابك والحمض النووي. في حين قد وصفت بعض البروتوكولات في الأدب، الكروماتين العامة انتشار تقنيات استخدام بويضات الثدييات الطور الأول محدودة وصعبة بسبب توقيت بدء الانقسام في المبيضين الجنين. وفي المقابل، يمكن جمع spermatocytes الطور الأول من الفئران الذكور الأحداث مع زيادة الغلات دون الحاجة إلى ميكروديسيكشن. ومع ذلك، من الصعب الحصول على عدد سكانها متزامنة نقية من الخلايا في مراحل محددة بسبب عدم تجانس السكان الخلية الجرثومية هو وهو بعد في الخصية الأحداث والبالغين. للمراحل المتأخرة من الانقسام الاختزالي، أنها مفيدة لتقييم بويضات يمر الانقسام الاختزالي الأول (مي) أو الانقسام الاختزالي الثاني (MII)، لأنه يمكن جمعها من الفئران الإناث البالغات مجموعات من بويضات ناضجة وحفز ليستأنف الانقسام الاختزالي في الثقافة. هنا، أساليب للاستعدادات الكروماتين هو انتشار استخدام بويضات تشريح من الجنين، حديثي الولادة والمبايض الكبار موصوفة بمصاحبة عروض فيديو. كروموسوم ميسيجريجيشن الأحداث في بويضات الثدييات متكررة، لا سيما خلال مي. يمكن استخدام هذه الأساليب لتقييم وتميز آثار الطفرات المختلفة أو التعرض البيئي خلال المراحل المختلفة لتكون البويضات. كما أن هناك اختلافات واضحة بين تكون البويضات والحيوانات المنوية، التقنيات الموضحة داخل لا تقدر بثمن لزيادة فهمنا لتكون البويضات الثديية والميزات ديمبرافيك جنسياً لديناميات كروموسوم والبروتين خلال الانقسام الاختزالي .
Introduction
خلال الحيوانات المنوية، موجات شبه متزامن كبيرة من الخلايا الجرثومية هو يتم بسرعة واستمرار تغذية في الخصية في بداية سن البلوغ، وطوال مرحلة البلوغ1. على النقيض من الذكور، وهو بدأ الانقسام في الإناث فقط أثناء التطور الجنيني. عقب الولادة، تظل بويضات المقبوض عليهم في مرحلة ديكتياتي طويلة من الطور الأول أنا مع حويصلة جيرمنال سليمة (غف؛ المغلف النووية) حتى سن البلوغ. في بداية سن البلوغ، يتم تحديد مجموعة فرعية بويضات دورياً للخضوع للنمو والنضج، الاحتفال ببدء استئناف هو. هو استئناف في بويضات شجيرة يتجلى اختفاء غف في عملية تعرف باسم حويصلة جيرمنال انهيار (جفبد). ثم يخضع البويضات كروموسوم التكثيف والعزل، متبوعاً بقذف الجسم القطبي. بويضات تصبح القبض عند التقدم لصناعة المعلومات وتحفز لاستكمال الشعبة هو الثاني والنهائي إلا بعد الإخصاب.
خصوبة الإناث يعتمد اعتماداً كبيرا على نجاح الطور الأول هو أنا التدرج. المفتاح لهذا هو تكوين الربط الفعلي بين الكروموزومات المتماثلة المعروفة باسم تشياسماتا، الذي هو توسط إصلاح فواصل مزدوجة حبلا الحمض النووي المستحث (دسبس) عن طريق وصلة التحويلة جزئ2. تحدث هذه العملية في سياق السقالة الغنية بالبروتين الحيوي المعروف باسم المجمع سينابتونيمال (SC) التي تشكل بين الكروموزومات المتماثلة لتسهيل على تشابك3. اتفاقية استكهولم هي الزمام مثل هيكل ثلاثي يتكون من عنصرين الجانبية متوازية متصلة بالمنطقة الوسطى البروتينات التي تحمل هومولوجس معا في جميع أنحاء الجارية إصلاح الحمض النووي. قبل انتصاف، تشكيل سلائف العناصر الجانبية، وتسمى العناصر المحورية، بين الأخت شقاً الصبغي. وتشكل البروتينات المعقدة سينابتونيمال مثل SYCP2 و SYCP3 العناصر المحورية التي كولوكاليزي على المحاور التماسك chromatid الشقيقة أثناء الطور الأول في وقت مبكر. هذه لاحقاً كمواقع للبروتين خيوط عرضية، SYCP1، مما يسهل الجمعية العنصر المركزي وتشابك بين homologs محاذاة4الربط. في بويضات الماوس، تشابك كاملة يتم الإشارة إلى وجود 20 تماما متداخلة تمتد SYCP3 و SYCP1، التي يمكن تصور باستخدام لونين انتشار الأعمال التحضيرية. اكتمال تشابك عند دخول [سوبستج] باتشيتيني، حيث زينت ناضجة عمليات الانتقال التي تتجه بشكل تشياسماتا بين هومولوجس موتل dimers homolog (MLH1/3) لتعزيز تلك المعالجة الدقيقة5،6 , 7-صون الهيكلية لمجمعات الكروموسومات (SMC)، بما في ذلك كوسين، كوندينسين، ومعقدة، SMC5/6 هامة لتنظيم كروموسوم ديناميات وهيكل خلال الانقسام الاختزالي8،9، 10،،من1112. مجتمعة، هذه الأحداث ضمان اتجاه ثنائية السليم من الكروموزومات المتماثلة لمعارضة أقطاب المغزل عقب تفكك المحكمة العليا.
دورة الخلية هو نموذج قوية لدراسة أدوار مختلف البروتينات في صيانة الجينوم بسبب التعريفي المبرمجة وإصلاح لاحقة من “دسبس الحمض النووي”. وعلاوة على ذلك، الانقسام الاختزالي الثدييات أيضا نموذج ذات صلة لدراسة تعديلات جينية والطباعة13. ومع ذلك، من الصعب من الناحية الفنية لتقييم هذه الأحداث أثناء الانقسام الاختزالي الإناث، الذي ينعقد في المبيضين الأجنة والأطفال حديثي الولادة في الثدييات (الشكل 1). ويمكن تقسيم المراحل الفرعية 5 الطور الأول: ليبتونيما، زيجونيما، باتشينيما، ديبلونيما وديكتياتي. وهنا، نحن تصف كيفية عزل والتمييز بين الأجنة والمواليد المبيض والخصيتين (الشكل 2). مقتبس من الأساليب المذكورة سابقا، وهذه المخطوطة يوجز أيضا بروتوكول (الخطوة 1) مع الفيديو مظاهرة لإعداد الإناث في الطور الأول هو أنا الكروماتين ينتشر14،،من1516،17 . عندما يقترن مع إيمونولابيلينج، كما هو موضح في الخطوات من 6-7، يتيح هذا البروتوكول مفصلة التحليل المجهري للطور الأول أنا الأحداث في بويضات.
تكون البويضات عرضه للخطأ، وتمثل الكروموسوم ميسيجريجيشن الأحداث خلال الشعبة الأولى هو المصدر الأكثر شيوعاً للأمراض الوراثية في نسل18،19. في هذه المخطوطة (الخطوة 2 من البروتوكول)، يصف لنا بروتوكول الذي يتم استخراج بويضات ناضجة نظموا غف من المبايض معبي من الفئران الإناث البالغات. تحت ظروف داعمة، يخضع بويضات شجيرة استئناف مستقلة عن الهرمون للانقسام بعد عزلة والثقافة20. وعقب استئناف هو، بويضات التقدم من خلال الانقسام الاختزالي أنا، ثم القبض على الطورية الثاني. بويضات تظل المقبوض عليهم في الطورية الثاني، ما لم يكن المخصبة. في الخطوات من 2-5، علينا أن نكيف بروتوكولات تم الإبلاغ عنها سابقا مع الفيديو مظاهرة لوصف كيفية جمع، الثقافة وإعداد بويضات مي وصناعة المعلومات ل الاستعدادات الكروماتين نشر21. يسمح هذا الكروماتين نشر تقنية إيمونولابيلينج واضحة من البروتينات المرتبطة بالكروموسومات. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا استخدامها للتمييز بين الكروموزومات الثنائي التكافؤ وأونيفالينت هذا البروتوكول، وكذلك حل واحد الأخت شقاً الصبغي لتيسير تقييم ploidy البويضات. لذلك، بالإضافة إلى الكشف عن أنماط البروتينات هو التعريب، هذا البروتوكول يمكن أيضا بمثابة أداة قيمة للغاية لتوضيح الأسباب المحتملة كروموسوم ميسيجريجاتيون خلال مي وصناعة المعلومات.
Protocol
Representative Results
Discussion
الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية تسمح للباحثين لدراسة زمنياً الانقسام الثدييات الإناث والتعريب الحيوي للبروتينات المشاركة. الحيزات الكروماتين الأجنة وحديثي الولادة تسمح بالتحليل الدقيق للأحداث في جميع أنحاء هو الطور الأول. الطورية والطوريه الثاني ينتشر الكروماتين يمكن استخدامها ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نيجمس (R01GM11755) إلى P.W.J وعلى تدريب منحة زمالة من الوطنية سرطان معهد (NIH) (CA009110) للزمان و J.H. كان تأييد هذا العمل
Materials
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
| 60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
| 35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
| Fine forceps | VWR | 300-050 | |
| Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
| Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
| Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| 50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
| Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
| Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| 16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
| Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
| Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
| PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
| Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
| Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
| Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
| Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
| Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
| Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
| 83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
| α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
| Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
| 500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
| Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
| VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear nail polish | Amazon | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
| Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
| Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
| Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |
Referências
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Keeney, S. Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis. Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).
- Vries, F. A., et al. Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation. Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).
- Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).
- Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).
- Lee, J. Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis. J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).
- Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. W., Hamer, G. Resolving complex chromosome structures during meiosis: versatile deployment of Smc5/6. Chromosoma. 125 (1), 15-27 (2016).
- Hopkins, J., et al. Meiosis-specific cohesin component, Stag3 is essential for maintaining centromere chromatid cohesion, and required for DNA repair and synapsis between homologous chromosomes. PLoS Genet. 10 (7), e1004413 (2014).
- Hwang, G., et al. SMC5/6 is required for the formation of segregation-competent bivalent chromosomes during meiosis I in mouse oocytes. Development. 144 (9), 1648-1660 (2017).
- Kota, S. K., Feil, R. Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis. Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).
- Taketo, T. Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation. Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).
- Sun, X., Cohen, P. E. Studying recombination in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).
- Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).
- Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
