クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備
Summary
哺乳類の卵形成がエラーを起こしやすい、染色体の紡錘のために特に知られています。この原稿は、マウス前期, クロマチンを広める準備方法をについて説明します中期私と卵母細胞の II 上演します。クロマチン結合蛋白質と哺乳類の卵形成過程で染色体の形態の研究を可能にするこれらの基本的なテクニック。
Abstract
クロマチン拡散技術は、配偶子、精子形成に特に様々 なタンパク質の動的局在を評価するために広く使用されています。これらのテクニックのシナプスと DNA 修復減数分裂において相同染色体対など中タンパク質と DNA の局在パターンの可視化を可能にします。いくつかのプロトコルは、文献に記載されている、哺乳類前期卵子を使用して一般的なクロマチン拡散技術が限られており、胎児の卵巣で減数分裂の開始のタイミングが難しい。比較では、前期の精母細胞はマイクロダイ セクションを必要とせずに高い利回りと少年の雄マウスから収集できます。しかし、少年と成人の精巣における減数分裂と後減数分裂生殖細胞集団の不均一性による特定の段階のセルの純粋な同期された人口を得ることが困難です。減数分裂の後の段階、卵母細胞成熟卵母細胞のグループは成熟雌マウスから収集および文化で減数分裂を再開する刺激できるので (mi) または減数分裂 II (MII) 減数分裂を受けてを評価すると便利です。ここでは、卵母細胞減数分裂クロマチンを広める準備法、胎児から新生児に解剖し、大人卵巣は、ビデオのデモを伴う説明。哺乳類卵母細胞の染色体紡錘イベントは、MI の間に特に頻繁に。行い卵形成の段階でさまざまな異なる突然変異や環境の露出の効果を特徴付けるこれらのテクニックを使用できます。内に記述された技術が減数分裂期哺乳類の卵形成過程の理解と染色体・ タンパク質ダイナミクスの性的に二形の機能を向上させる貴重なは配偶子形成の間の明確な相違点があると.
Introduction
精子、中に思春期と成人1発症時精巣生殖細胞の減数分裂の大波は準同期を急速に継続的に補充されます。男性とは対照的女性で減数分裂が胎児の発育中にのみ開始されます。誕生、次卵母細胞のまま前期の長期 dictyate 段階で逮捕された私は、そのまま卵核胞 (GV; 核膜) 思春期まで。思春期の発症時は、卵母細胞のサブセット周期的成長と成熟、減数分裂再開の開始をマークを受けることが選択されます。完全育てられた卵母細胞の減数分裂再開は胚胞崩壊 (GVBD) として知られているプロセスの GV の消失によって明示されます。卵母細胞は、染色体凝縮と極体押出続く分離を経る。卵母細胞は MII への進行時に逮捕になるし、が受精後にのみ 2 番目と最終的な減数分裂を完了する刺激されます。
雌の受胎は減数分裂前期の成功に大きく依存私進行。このための鍵は、物理的なリンケージを介したクロス オーバー組換え2を介して誘導の DNA 二重鎖切断 (Dsb) の修理 chiasmata として知られている相同染色体間の形成です。このプロセスは、そのシナプス3を容易にする相同染色体の間を形成する減数分裂 (SC) として知られている動的タンパク質豊富な足場のコンテキスト内で発生します。SC はジッパーのような三者構造中部の蛋白質によって接続されている 2 つの平行横要素から成る継続的な DNA 修理を通して一緒に同族体を保持しています。シナプス前、軸の要素と呼ばれる外側の要素の前駆体姉妹染色分け体を形成します。SYCP2 など SYCP3 減数分裂タンパク質は、初期前期中には姉妹染色分け体結束軸 colocalize 軸の要素を形成します。これらの後結合横フィラメント蛋白質、SYCP1 は、容易にアセンブリ中心的な要素と一直線に並べられた同族体4の間のシナプス部位として機能します。マウス卵母細胞の完全なシナプスによって示されます 20 の存在完全に準備を広げる重複 SYCP3 と SYCP1 のストレッチ、クロマチンを使用して視覚化することができます。シナプスが完了するという同族体間フォーム chiasmata を宛先とする成熟したクロス オーバーが飾られて mutL 相同物 (MLH1/3) ダイマーの正確な処理5,6を促進するために pachytene サブステージに入る時に,7. コヒーシン、コンデンシン、複雑な SMC5/6 など染色体 (SMC) 錯体の構造のメンテナンスが減数分裂8,9、全体構造と染色体ダイナミクスの制御のために重要 10、11,12。総称して、これらのイベントは紡錘体極次の SC の解体に反対する相同染色体の適切な双方向を確保します。
減数分裂の細胞周期は、ゲノム維持プログラム誘導と発癌の後続の修理のための様々 な蛋白質の役割について検討する強力なモデルです。さらに、哺乳類の減数分裂も、エピジェネティック修飾と刷り込み13の研究に関連するモデルです。ただし、女性減数分裂 (図 1) の哺乳類の胎児・新生児の卵巣で行われるこれらのイベントを評価するために技術的に困難です。前期 5 サブステージを分かれますことができます: leptonema、zygonema、pachynema、diplonema、dictyate。ここで、分離および胎児・新生児の卵巣と精巣 (図 2) を区別する方法をについて説明します。上記の方法から適応、この原稿も女性減数分裂前期の準備のためのビデオのデモとプロトコル (手順 1) の概要私クロマチン広がる14,15,16,17.このプロトコルにより前期の詳細なミクロ分析、immunolabelling、6-7 の手順で説明したようとつながれたとき私卵母細胞でのイベント。
卵はエラーを起こしやすいと第一減数分裂時に染色体紡錘イベントを表す子孫18,19の遺伝病の最も一般的なソース。本稿では (プロトコル手順 2)、GV 段の成熟した卵子を成熟雌マウスの発動を促された卵巣から抽出しプロトコルについて述べる.支持条件の下では、完全育てられた卵母細胞は黄体形成ホルモンに依存しない次の分離と培養20減数分裂の再開を受けます。減数分裂の再開後卵母細胞は減数分裂を経て進行し、中期 II で逮捕。卵母細胞は限り受精.中期 II で逮捕されました。手順 2-5、以前に報告されたプロトコルの収集、文化およびクロマチンを広める準備21MI と MII 卵子を準備する方法を説明するビデオ デモを適応させます。技術を広めるこのクロマチン染色体に関連付けられている蛋白質の明確な immunolabelling が可能です。さらに、このプロトコルし一価、二価染色体を区別するためにも使用できます、さらに単一の妹を解決できる卵母細胞の倍数性の評価を容易にする染色分け体。したがって、減数分裂タンパク質の局在パターンを明らかに加えこのプロトコルも MI と MII の間に染色体紡錘の潜在的な原因を解明するための非常に貴重なツールとして使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
クロマチン普及準備は、年代順に女性哺乳類減数分裂とタンパク質の動的局在の研究に研究を許可します。胎児・新生児のクロマチン スプレッド行事が減数分裂前期の綿密な分析を可能にします。中期私と中期 II クロマチン スプレッドを使用と単一の妹を区別できますから染色分け体一対姉妹と一対の相同染色体倍数性の評価と同様。比較では、ここで説明したプロトコルできる有利な頻?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は日の出 (R01GM11755) に P.W.J、g. h. と j. h. 訓練助成フェローシップ国立がん研究所 (NIH) (CA009110) からサポートされていた
Materials
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
| 60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
| 35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
| Fine forceps | VWR | 300-050 | |
| Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
| Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
| Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| 50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
| Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
| Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| 16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
| Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
| Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
| PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
| Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
| Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
| Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
| Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
| Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
| Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
| 83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
| α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
| Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
| 500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
| Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
| VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear nail polish | Amazon | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
| Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
| Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
| Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |
Referências
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