Det här protokollet beskriver användning av en modifierad T-maze att utvärdera funktionella lärande/minne i asfyxi hjärtstillestånd-inducerad cerebral ischemi.
Bakgrund: Utvärdering av mild till måttlig kognitiv svikt hos en global cerebral ischemi (dvs hjärtstillestånd) modell kan vara svårt på grund av dålig locomotion efter operation. Till exempel kan råttor som genomgår kirurgiska ingrepp och utsätts för Morris vatten labyrinten inte kunna simma, således tömning experimentet.
Ny metod: Etablerade vi en modifierad beteendemässiga spontana växlingen T-maze test. Den stora fördelen med modifierad T-maze protokollet är dess relativt enkel design som är tillräckligt kraftfullt för att bedöma funktionella lärande/minne efter ischemi. Dessutom, är dataanalys enkel och okomplicerad. Vi använde T-maze för att bestämma råttornas lärande/minne underskott både i närvaro eller frånvaro av mild till måttlig (6 min) asphyxial hjärtstopp (ACA). Råttor har en naturlig tendens för utforskning och kommer att undersöka alternativa armarna i T-maze, Hippocampus-bort råttor tenderar att anta en side-preferens som resulterar i minskad spontan växlingen nyckeltal, avslöjar den Hippocampus-relaterade funktionella lärande/minne i närvaro eller frånvaro av ACA.
Resultat: ACA grupper har högre sida-preferens nyckeltal och lägre växlingen jämfört med kontroll.
Jämförelse med befintliga mätmetoder: The Morris vatten och Barnes labyrint är mer framträdande för att bedöma lärande/minnesfunktion. Men är Morris vatten labyrinten mer stressande än andra labyrinter. Barnes labyrinten är ofta används för att mäta referens (långsiktiga) minne, medan ACA-inducerad neurokognitiva brister är mer närbesläktade med arbetar (korttidsminnet).
Slutsatser: Vi har utvecklat en enkel, men effektiv strategi för att avgränsa arbetar (korttidsminne) via T-maze i vår globala cerebral ischemi modell (ACA).
Enligt American Heart Association (2017), hjärtstillestånd (CA)-inducerad dödligheten inträffar varje fyra minuter och påverkar över 400 000 personer per år i USA1. Det är väl dokumenterat att CA kan orsaka neuronala hjärnskada till följd av otillräcklig blod perfusion2,3,4. CA-inducerad hjärnskada uppstår i regionen ischemi-känsliga CA1 i hippocampus5,6,7, som påverkar nervceller som är viktiga för inlärning och minne8,9, 10,11,12. Dessutom spelar förlusten av dendritiska ryggraden densitet, ischemisk villkor i hippocampus (dvs CA1 nervceller), en avgörande roll i rumsliga minne nedskrivningar13,14,15. På grund av dessa patologiska förändringar efter CA, beteendemässiga störningar såsom: ångest, depression, posttraumatiskt stressyndrom och minnesförlust är vanligare. Även om det har skett framsteg inom medicinsk teknik (dvs effektiv ambulatory service) som korrelerar med förbättrade CA överlevnaden, misslyckas de flesta av de nervskyddande behandlingarna (utom hypotermi) att förbättra funktionella resultat efter CA16 ,17. CA överlevande normalt har en dålig livskvalitet och belastas med inkrementell medicinska utgifter16.
Kognitiv status bedömningar för cerebral ischemi via beteendemässiga tester är viktiga för att fastställa både drogen effekt och slutligen utveckla en framgångsrik klinisk prövning. I 1940 konstruerade Edward Tolman den första beteende rättegången att studera hippocampus-baserade rumsliga minne18. Därefter utvecklades olika labyrinter (dvs. Morris vatten labyrinten, radiella labyrint, T – eller Y-labyrint, och Barnes labyrint) för att utvärdera Hippocampus-baserade spatial inlärning och minne i råttor19,20,21,22 ,23. En mer utbredd beteendemässiga testet är Morris vatten labyrinten, som undersöker spatial inlärning och minne hos råtta modeller24. Morris vatten labyrinten kräver dock råttan att bada och utöva full motorisk funktion och kontroll. För ischemi experiment såsom asphyxial hjärtstopp (ACA, en råtta modell av CA) modellen, kanylering av femoral artär/ven krävs för att få avgörande blodtryck, blodgaser och införandet av olika droger. Eftersom femoral artär/ven kanylering kan hämma ben rörlighet rendering råttans förmåga att simma ordentligt, kanske Morris vatten labyrinten inte den mest lämpliga att testa kognitiva funktionsnedsättningar enligt ACA.
Barnes labyrinten är det andra utbredda beteendemässiga testet att undersöka spatial inlärning och minne i djurmodeller. Barnes labyrinten kräver inte ansträngning av full motorisk funktion och kontroll, och därmed mindre stressande än Morris vatten labyrinten. Tidigare har vi utfört experiment med Barnes labyrinten för att avgöra om funktionella lärande/minne skillnader förekomma mellan kontroll eller sham kontra ACA-inducerad råttor. Uppgifterna som erhållits för Barnes labyrinten inte hade resolutionen att testa kognitiva nedsättningar efter mild till måttlig ACA på grund av att Barnes labyrinten ofta används för att mäta referens (lång sikt) minne25,26, medan ACA-inducerad neurokognitiva brister mer närbesläktade med arbetar (kortsiktiga) minne27,28,29,30 tyder på att Barnes labyrinten är mindre lönsamt för bedömning av minnesfunktion i vår ACA modellen.
Därför utvecklade vi en modifierad T-maze med spontana växlingen testet för att utvärdera arbetar (korttidsminne) efter ACA. Modifierad T-maze spontana växlingen testets stora fördel är dess enkelhet och minimal påfrestning på råttor jämfört med andra beteendemässiga tester på grund av att den modifierade T-maze inte kräver djur utbildning, som väl så tung computational analys eller sub rutiner (dvs. video imaging av tjalla) som krävs enligt Morris vatten labyrinten och Barnes labyrint. Här visar vi att modifierade T-maze spontana växlingen testet är ett enkelt och ändå högeffektiv beteendemässiga rättegång paradigm som kan erbjuda tillräcklig upplösning för att exakt identifiera och utvärdera Hippocampus funktion i sjukdomar som orsakar kortvarig minnesförlust (dvs. ACA).
Ändringar har gjorts i den aktuella studien jämfört med Deacon och Rawlins’ protokoll31. Den 3D-skrivaren användes till att bygga T-maze. Den 3D-printing erbjuder prisvärt och kostnadseffektivt alternativ till kommersialiserade T-maze. För att minska råttornas ångest under provningen, utfördes T-maze i det mörka rummen med minsta belysning. När råttan angett ett mål armar, blockerat vi försiktigt den motsatta armen. Detta undviker möjliga stress från det test, liksom eventuella ska…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete fick stöd av de nationella institut för hälsa och nationella institutet av neurologiska sjukdomar och Stroke bevilja 1R01NS096225-01A1, American Heart Association beviljar AHA-13SDG1395001413, AHA-17GRNT33660336, AHA-17POST33660174, den Louisiana State University Grant i stöd research council, The Malcolm Feist kardiovaskulär forskning Fellowship, och Evelyn F. McKnight Brain Institute.
3D Printer | MakerBot | Replicator | Fifth generation |
3D Printer Filament | Hatchbox | PLA, 1.75 mm filament diameter | |
200 Proof Pure Ethanol | Koptec | V1005SG | |
Sani-Chips | PJ Murphy-Forest Products | Size: 8 to 20 mesh; 2.2 cubic foot/package; autoclavable bags | |
Rat | Charles River Laboratories | Sprague-Dawley | |
Vecuronium bromide | Sun Pharmaceutical | 47335-931-40 | 10 mg |
Epinephrine | Par Pharmaceutical | 42023-103-01 | Adrenalin Chloride Solution 1 mg/mL, 1:1000 |
Buprenorphine Hydrochloride Injection | Pfizer | 00409-2012-32 | 0.3mg/mL |
SketchUp | Trimble Inc. | 3D modeling software | |
VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | Animals raging in size from mouse to guinea pig (10g to 1kg) |
PowerLab 8/35 | Adinstruments | PL3508 | 8 analog input channels – 4 of which can be used in differential mode. |
Bio Amps | Adinstruments | FE132 | The Bio Amp is a galvanically isolated, high-performance differential bio amplifier optimized for the measurement of a wide variety of biological signals such as ECG, EMG and EEG recordings. |
Quad Bridge Amp | Adinstruments | FE224 | A four-channel, non-isolated bridge amplifier designed to allow the PowerLab to connect to most DC bridge transducers. |
LabChart 8 | Adinstruments | ||
ABL80 FLEX CO-OX blood gas analyzer | Radiometer | pH / p CO2 / p O2 | |
SURFLO Teflon I.V. Catheter | Terumo | sc-361556 | Only use the flexible thin wall catheter (49-mm long) |
Pipet/Infusion Needle | Hamilton | 7748-03 | 17-gauge; 93-mm long; 10-degree angle |
Classic T3 Vaporizer | SurgiVet | VCT302 | Classic T3 Isoflurane Funnel Fill |
ENVIRO-PURE Charcoal Canister | SurgiVet | 32373B10 | Designed to absorb waste anesthetic gas |
O2 single flowmeter | SurgiVet | 32375B1 | 0-1000 mL |
N2O Flowmeter | VetEquip | 401721 | 0-4LPM |
Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter (Sterile) | Becton Dickinson | 427565 | 23 gauge |
Micro Forceps | Black and Black surgical | B3FRC-18 RM-8 | 7 1/4" (18 cm), 8mm RH, counterweight w/ guide pin 2mm, platform 6 x .3 mm, curved. |
Halstead Mosquito Forceps | Roboz | RS-7111 | Curved; 5" Length, 1.3 mm tip diameter, 2.1 mm jaw width |
Mixter Forceps | Roboz | RS-7291 | 5.25" Curved Extra Delicate, 1.1 mm tips |
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | Straight, Sharp Points; 9 mm Cutting Edge; 0.15 mm Tip Width; 3 1/2" Overall Length |
Mayo-Stille Scissors | Roboz | RS-6891 | 5.5" Round Curved |
Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | 45 Deg Dumoxel Tip Size .10 x .06 mm |
Olsen-Hegar Combination Scissor And Needle Holder | Roboz | RS-7884 | Cross Serration Tip; 5.5" Length |
Moloney Forceps | Roboz | RS-8254 | Serrated; Slight Curve; 4.5" Length |