Murine 골 복 막 대 식 세포 활성화에 대 한 항 체 기반 약물 효과의 평가
Summary
항 체 기반 약물 염증 성 질병을 위한 처리를 혁명 있다. 데 뿐만 아니라 특정 대상에 대 한 직접 효과, 항 체 항 염증 되는 세포를 활성화할 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명 합니다 어떻게 항 염증 제 대 식 세포 활성화 평가 생체 외에서, 마우스 골 수 세포, 그리고 vivo에서 복 막 대 식 세포를 사용 하 여 사용 될 수 있습니다.
Abstract
대 식 세포는 phagocytic 타고 난 면역 세포는 병원 체에 대 한 면역 응답을 시작 하 고 치유와 조직 회복을. 대 식 세포는 선 동적인 응답을 해제에 동등 하 게 중요 하다. 우리 세포 정 맥 면역 글로불린 (IVIg)와 자극된의 다량 항 염증 성 사이토카인, 인터 루 킨 10 (IL-10), 그리고 세균 lipopolysaccharides (응답에서 프로 염증 성 cytokines의 저급 생산할 수 있는 것으로 나타났습니다. LPS)입니다. IVIg는 1000 명 이상의 혈액 기증자의 플라즈마에서 풀링된 다 원자가 항 체, 면역 글로불린 Gs (IgGs), 주로. 면역 결핍증 환자에서 항 체를 보완 하기 위해 또는 면역 또는 염증 성 조건 가진 환자에 있는 면역 반응 억제에 사용 됩니다. Infliximab, 치료 항 종양 괴 사 요인 알파 (TNFα) 항 체 또한 염증 성 자극에 대 한 응답에서 IL-10를 생산 하는 세포를 활성화 하기 위해 표시 되었습니다. IVIg 및 다른 항 체 기반 생물 의약품은 대 식 세포 활성화에 미치는 영향을 확인 하기 위해 테스트할 수 있습니다. 이 문서에는 파생, 자극, 및 murine 골 수 세포를 체 외에서 항 체에 의해 활성화와 murine 복 막 대 식 세포 항 체 비보와 활성화의 평가 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 항 염증 제 대 식 세포 활동 통로 신호 하는 특정 셀의 기여를 결정 하 게 더 럽 히기 서쪽의 사용을 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 항 염증 제 대 식 세포 활성화에 특정 protein(s)의 효과 결정 하 유전자 변형된 생쥐와 함께 사용할 수 있습니다. 이러한 기술은 특정 biologics 세포 선 동적인 응답 비보를 감소 시키는 IL 10 생산 하는 항 염증 제 활성화 상태를 변경 하 여 행동 수 있습니다 여부를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 질병 모델 생쥐, 동안 생물 의약품의 효능에 대 식 세포 활성화의 역할에 대 한 정보를 제공 하 고 사람에서 행동의 잠재적인 새로운 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 반대로,이 수 주의 특정 항 체 기반 생물 의약품의 사용에 대 한 전염 성 질병을 치료 하 대 식 세포는 감염에 대 한 호스트 방어에 중요 한 역할을 재생 하는 경우에 특히.
Introduction
대 식 세포는 면역 반응에 여러 역할 감염이 나 부상에 타고 난 면역 세포. 대 식 세포는 감염이 나 조직 손상에 대 한 면역 응답을 시작, 선 동적인 응답을 중지 및 치유 응답1을 홍보 하는 일을 담당 합니다. 3 최고의 공부 대 식 세포 활성화의 예: 1) 대 식 세포 치료 인터페론 감마 (IFNγ)와 세균 lipopolysaccharide (LPS), M (IFNγ + LPS)는 염증 반응;을 지정 2) 대 식 세포와 인터 루 킨 4 (IL-4), M(IL-4), 자극된 치료 응답;과 관련 된 3) 면역성이 있는 복합물 (IC)와 자극된 세포와 LPS, M (IC + LPS)는 염증 반응2,3해제 하는 기능이 있다. M (IC + LPS) M(IL-4) 상처 치유, 세포에서 고 효소 arginase (Arg-1) 또는 FIZZ14를 표현 하지 않습니다. 이러한 염증 세포에 대 한 최고의 마커는 그들의 cytokine 생산5입니다. 세포 건강을 유지 하는 데 여러 역할 하지만 또한 염증 성 질환 및 암3에 기여. 이 때문에, 대 식 세포는 다양 한 질병의 치료에 대 한 주요 치료 대상. 그것은 질병에 대 한 대 식 세포 기반 치료를 개발 하기 위해 그들의 활성화 상태에 대 한 항 체의 효과 조사 해야 합니다.
이 문서의 초점은 파생 murine 골 수 세포 (BMDMs) 및 선 동적인 응답 생체 외 및 생체 내에서항 체 약물의 효과 테스트 하는 복 막 대 식 세포의 사용에 있습니다. 최근, 대 식 세포 활성화6,,78에 항 체의 효과 보여주는 여러 연구 되었습니다. 대 식 세포는 항 체 항 원, 및 LPS, 일반적으로 염증 성 자극 complexed 면역 단지와 활성화 공동 항 염증 성 사이토카인, IL-10와 프로-염증 성 cytokine의 매우 낮은 레벨의 매우 높은 수준의 생산 인터 루 킨 12 (IL-12)9. 또한, infliximab, TNFα에 대하여 단일 클론 항 체에 작동 하는, 부분적으로, 그것의 조각 crystallizable (Fc) 지역7염증 세포를 유도 하 여 발견 되었습니다. 우리 보고 IVIg + LPS M (IC + LPS), 공동 자극된 세포 많은 양의 IL-10과 23 p40 (또는 소 단위 프로-염증 성 사이토카인 인터 루 킨 12의 낮은 금액을 생산 하는 점에서 유사한 항 염증 제 대 식 세포 활성화 유도 IL-12/23p40), 인터 루 킨-6 (일리노이-6), 그리고 TNF8. IVIg polyclonal 항 체의 구성 하는 약 주로 IgG, 1000 명 이상의 기증자10의 혈액에서 풀링된 되는 이다. Idiopathic thrombocytopenic 혈관 등 만성 demyelinating 증, 면역 질환의 광범위 한 치료 하는 데 사용은 하지만 행동의 그것의 기계 장치는 완전히 이해11. 대 식 세포 활성화에 대 한 항 체 기반 약물의 효과 여기 설명 된 방법을 사용 하 여 평가 될 수 있다.
BMDMs 및 복 막 대 식 세포 대 식 세포 활성화에 특정 생물 의약품의 효과 테스트할 수 있습니다. 이 대 식 세포 소스를 사용 하 여 1 차 셀의 평가 허용 합니다. 예비 테스트 교양된 1 차 셀에 항 체의 적은 시간과 다른 시간이 소모 및 비싼 질병 모델 보다 통화 투자 필요 합니다. 주입 약을 건강 한 마우스에서 vivo에서, 그리고 셀을 절연 하 고 비보 전분석, 한 연구는 생물 의약품으로 치료에 영향을 미치는 질병 모델에서 대 식 세포 활성화 여부를 평가 하기 위해 보증을 확인할 수 있습니다.
대 식 세포 활성화 생체 외 및 생체 내에서 생물 학적 치료의 효과 직접 테스트 하는 몇 가지 연구, 우리의 기술을 대체 기술을 통해 이점을 제공 합니다. 현재 기술 포함 혼합된 셀 인구에서 생체 외에서주변 혈액 단 세포, 인간의 세포에는 반응 혼합된 림프 구 (미르) 또는 IVIg infliximab의 효과 같은 생물 학적 약물 효과 테스트 어디 효과 특정 세포 유형7,12에 표시 될 수 없습니다. BMDMs를 사용 하 여 복 막 대 식 세포는 유리 RAW264.7 세포, 프로-염증 성 사이토카인을 생산 하지 않습니다, 같은 셀 라인을 사용 하 여 IL-12, LPS8,13에 대 한 응답. 대 식 세포 응답 ex vivo에 는 항 체 기반 약물의 효과 테스트 cytokine 응답 대 식 세포, 직접 할당 될 수 있기 때문에 이점이 있다 보다는 혈 청 사이토카인 수준14 측정 하 여 대 식 세포 응답을 유추 . BMDMs 및 복 막 대 식 세포를 파생 하 고 항 염증 제 대 식 세포 활성화에 있는 단백질의 특정 역할을 결정 하는 유전자 변형된 쥐에서 분리 수 있습니다. 예를 들어 우리 Il10 결핍 사용(-/-) IVIg 유도 프로-염증 성 cytokine 생산의 감소는 IL-108에 부분적으로 의존을 설명 하는 BMDMs. 활동의 기계 장치는 약의 서 부 럽, 특정 단백질 및 신호 이벤트의 역할을 확인할 수 있습니다을 사용 하 여 조사 수 있습니다. 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) BMDMs 또는 복 막 대 식 세포 항 체 활성화에 기인 하는 유전자 발현의 패턴을 보여주는 것에 수행할 수 있습니다. 질병 모델 생쥐에서 모델에서 항 체 기반 생물 학적 치료의 잠재적인 효 험에 염증 성 장 질환, 류 마티스 관절염과 암15,16, 같은 질병에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 그러나 17., 여기에 설명 된 기술 정보를 제공 합니다 이러한 생물 의약품의 행동의 메커니즘에 그들은 항 염증 제 대 식 세포 활동을 유도 하는 여부를 확인 하 여.
Protocol
Representative Results
Discussion
대 식 세포 활성화 상태 두 조직의 항상성 및 질병22에 중요 한 역할을 한다. 대 식 세포 활성화 상태, 그들의 microenvironment3에서 신호에 따라 중복 뿐만 아니라 고유 할 수 있습니다. 그들은 염증 반응의 모든 단계에 있는 명백한 역할: 병원 체에 대 한 방어, 상처 치유 및 조직 회복, 그리고 또한 염증 반응2 해제에 대 한 중요 한 다른 항 염증 제 활성?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.K.는 브리티시 컬럼비아의 대학 4 년 친교 (4YF) 대학원 재학 상 받는 사람입니다. L.M.S.은 위장의 캐나다 협회의 받는 사람 / 크 론 및 Colitis 캐나다 CIHR 새로운 탐정 급여 수상 / 건강 연구를 위한 마이클 스미스 재단의 생물 의학 학자입니다. 이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회 (# CIHR2016-LS 부여)와 공동으로 캐나다 혈액 서비스에서 프로젝트 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
Referências
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13 (2014).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
- Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
- Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
- Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777 (2013).
- Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, 10-20 (1996).
- Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
- Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
- Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
- Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
- Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160 (2014).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
- Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
- Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
- Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins–understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, 2-13 (2009).
- Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
- Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).
