Обнаружение Rab10 фосфорилирования LRRK2 деятельностью с помощью SDS-страницы с тегом фосфат привязки

PD-один из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний, преимущественно затрагивающих дофаминергических нейронов мозга, что приводит к дисфункции Мотор систем в пожилых людей¹. В то время как большинство пациентов развивается PD в виде спорадических, есть семьи, наследования заболевания. Увязываться с FPD²были найдены мутации в нескольких генов. Один из причинных генов для FPD является LRRK2, в котором восемь Миссенс-мутации (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S и I2020T) связан с преимущественно унаследованные FPD называется PARK8 пока не сообщил^3,4,5. Несколько исследований генома всей ассоциации (GWAS) спорадические PD пациентов выявили также геномной вариации в локусе LRRK2 как фактор риска для PD, предполагая, что ненормальности в функции LRRK2 является распространенной причиной нейродегенеративные в обоих спорадические и PARK8 FPD^6,,78.

LRRK2 — это большой белок (2527 аминокислоты) состоящий из лейцин богатые домен, GTP-привязки РАН сложных белков (ROC) домена, C-терминал домена, домен киназы протеина Серин/треонин и WD40 домен⁹ROC (кор). Восемь мутации FPD найти в этих функциональных областях; N1437H и R1441C/G/H/S в домене ROC, Y1699C в домене COR, G2019S и I2020T в домене киназы. Так как мутация G2019S, который наиболее часто встречается мутации в PD пациентов^10,11,12, увеличивает активность протеинкиназы LRRK2 на 2-3 раза в vitro¹³, можно предположить что аномальное увеличение фосфорилирование LRRK2 substrate(s) является токсичным для нейронов. Однако это было невозможно изучить ли фосфорилирование физиологически соответствующих LRRK2 субстратов изменяется в семейной/спорадические PD пациентов из-за отсутствия методов оценки пациентом производных выборок.

Фосфорилирование белков определяется как правило immunoblotting или энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) с использованием антител, конкретно признавая фосфорилированных состояние белков или масс-спектрометрических анализа. Однако бывший стратегии иногда нельзя применить из-за трудностей в создании фосфорилирования специфические антитела. Метаболические маркировки клеток с радиоактивными фосфатов является еще одним вариантом для изучения физиологических уровней фосфорилирования, когда фосфорилирования специфические антитела не доступны. Однако он требует большого объема радиоактивных материалов и поэтому включает в себя некоторые специализированное оборудование для радиационной¹⁴. Масс-спектрометрических анализ является более чувствительными по сравнению с этим иммунохимические методы и стал популярен в анализе фосфорилирование белков. Однако подготовка образца является длительным, и дорогих инструментов, необходимых для анализа.

Подмножество Rab ГТФазы семьи, включая Rab10 и Rab8 недавно было сообщено как прямым физиологическим субстраты для LRRK2 основанный на результатах анализа крупномасштабных phosphoproteomic¹⁵. Затем мы показали, что фосфорилирование Rab10 была увеличена на FPD мутации в мыши эмбриональных фибробластов и легкие knockin мышей¹⁶. В настоящем докладе, мы решили использовать электрофорез геля полиакриламида сульфата натрия Додециловый (SDS-PAGE)-на основе метода, в котором молекулы тега P совместно полимеризованной на гелях SDS-PAGE (P-тег SDS-PAGE) для обнаружения эндогенными уровнями фосфорилирование Rab10, потому что высокочувствительный антител специфических для фосфорилированных Rab10 по-прежнему отсутствует. Мы не смогли обнаружить фосфорилирование эндогенного Rab8 за счет бедных избирательности в настоящее время антител для всего Rab8. Поэтому мы решили сосредоточиться на Rab10 фосфорилирования. LRRK2 фосфорилирует Rab10 в Thr73 поиске в середине региона весьма сохраняется «переключатель II». Высокая сохранения фосфорилирование сайтов среди Rab-белков может быть одной из причин, почему phosphospecific антител, признавая различные белки раб трудно сделать.

Фосфорилирование Rab8A, LRRK2 ингибирует связывание Rabin8 фактор обменом нуклеотида гуанина (ГЭФ) который активирует Rab8A путем обмена связанный ВВП с GTP¹⁵. Фосфорилирование Rab10 и Rab8A, LRRK2 также ингибирует связывание ВВП диссоциации ингибиторов (GDIs), которые необходимы для активации Rab-белков путем извлечения ВВП прыгните Rab-белков из мембраны¹⁵. Коллективно можно предположить, что фосфорилирование белков раб, LRRK2 предотвращает их от активации, хотя точный молекулярный механизм и физиологические последствия фосфорилирование остаются неясными.

P-тег SDS-PAGE была изобретена Киносита et al. в 2006 году: В этом методе, акриламид ковалентно наряду с тега P, молекулы захвата фосфатов с высоким сродством, который Сополимеризованная в SDS-PAGE гели¹⁷. Потому, что молекулы P-тега в виде геля SDS-PAGE выборочно ретард электрофоретической подвижности фосфорилированных белков, тег P SDS-PAGE можно отделить фосфорилированных белки от не phosphorylated из них (рис. 1). Если протеин интереса фосфорилированных на нескольких остатков, лестница полос, соответствующий дифференциально фосфорилированных формы будет соблюдаться. В случае Rab10 мы наблюдаем только одна группа смещается, указав, что Rab10 фосфорилированных только на Thr73. Основным преимуществом тега P SDS-PAGE над immunoblotting с фосфорилированием специфические антитела является, что фосфорилированных Rab10 могут быть обнаружены путем immunoblotting с не фосфорилирования специфические антитела (т.е., узнавая всего Rab10) После перевода на мембраны, который как правило более конкретными, чувствительной и доступны из коммерческих/академических источников. Еще одно преимущество использования тега P SDS-PAGE, что можно получить приблизительную оценку стехиометрии фосфорилирование, который невозможно путем immunoblotting с фосфорилированием специфические антитела или маркировки метаболизм клеток с радиоактивными фосфаты.

Помимо использования недорогой тега P акриламида и некоторые незначительные изменения, связанные с ним нынешний метод для обнаружения Rab10 фосфорилирования, LRRK2 следует общий протокол immunoblotting.Таким образом его следует просто и легко исполняемый в любой лаборатории, где immunoblotting является обычной практикой, с любыми типами образцов, включая очищенные белки, lysates клетки и ткани гомогенатах.