合成とオリゴ ペプチドの質量分析
Summary
プロトコルは質量分析法によるオリゴ ペプチドの配列解析に続いての手動合成についてください。
Abstract
ペプチドは、N-アルキル グリシン ユニットで構成されるシーケンス制御ペプチド模倣オリゴマーです。多くの潜在的なアプリケーション間で、ペプチドは、分子情報ストレージの種類としての考えられてきました。質量分析は、配列ペプチドの選択の方法を考えられています。ペプチドは、繰り返し 2 段階反応サイクルを用いた固相化学経由で合成できます。タンデム質量分析 (MS/MS) 技術を用いたペプチドの順序を分析する手動でオリゴ ペプチドを合成する方法をご紹介します。サンプル peptoid は、n-(2-アミノエチル) グリシン (ナエ) N 末端と同様に n-(2-methyloxyethyl) グリシン (Nme) と n-(2-フェニルエチル) グリシン (Npe) を交互に構成される nonamer です。Peptoid のシーケンス式は Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2Ac がアセチル基であります。合成は、市販の固相反応容器で行われます。スケート リンクのアミド樹脂は C 末端にアミド基をもつ peptoid を生成する固体のサポートとして使用されます。結果の peptoid 製品は、エレクトロ スプレー イオン化ソースに結合トリプル四重極質量分析計を用いたシーケンス解析を受けます。MS/MS 測定は、充電 peptoid の解離から生じるフラグメント イオンのスペクトルを生成します。フラグメント イオン質量電荷比 (m/z) の値を基に並べ替えられます。フラグメント イオンの m/z 値は peptoid 断片化のスキームに従って理論的に予測されたフラグメント イオンの名目の固まりと比較されます。分析は、充電 peptoid のフラグメント パターンを生成します。断片化パターン中立的な peptoid のモノマー シーケンスに相関しています。この点で、質量分析は、ペプチドのシーケンス情報を読み出します。
Introduction
ペプチドは、ペプチドの構造を模したバックボーン構造を持つシーケンス制御された高分子のクラスです。ペプチド合成できる多様なアミンから高度可変プロパティ1,2を展示するペプチドを可能にします。ペプチドは、生物物理学的研究、治療薬として考えられている、タンパク質3,4,5,6配位子として設計されて分子モデルとして使用されています。ペプチドは、防汚と抗体ミメティック材料、抗菌薬、酵素阻害剤7,8,9などの生理活性物質の多様性に開発されています。高い順序と可変自然とペプチドも考えられたの分子情報ストレージ10の種類として。シーケンスとペプチドの構造を特徴付けるため効率的な分析法の開発のためのこれらの多様なアプリケーション呼び出しの発見。タンデム質量分析を用いた手法は、ペプチド11,12,13を含む、シーケンス制御された高分子のシーケンスのプロパティを分析するための選択の方法として約束を示しています。 14,15。しかし、体系的な研究から生じる peptoid イオン断片化パターンを関連付ける質量分析研究、ペプチドの構造情報が非常に限られました。
ペプチドは、固相メソッドを使用して容易に合成することができます。よく発達したメソッドには、2 段階モノマー添加サイクル16,17のイテレーションが含まれます。またサイクルごとに樹脂連結アミンはハロ酸 (通常ブロモ酢酸、BMA)、によってアセチル化し、第一次アミンの置換反応が続きます。標準化学研究所16,18,19、で優秀な利回りとペプチドを手動で合成できる自動合成プロトコルは、peptoid 合成の日常的に適用されているが20。
当研究室は、手動 peptoid 合成法を採用したあり、既存のメソッドで使用される装置を簡略化します。ペプチド ・ MS/MS テクニック21,22,23を使用して一連の分裂パターンは学んだこともあります。衝突誘起解離 (CID)21,23にさらされるまたは電子捕獲解離 (ECD)22実験時、ペプチドが特徴的な分裂を生成することが分かった。この記事では、標準的な化学実験室でのオリゴ ペプチドの合成方法、トリプル四重極の質量分析計を用いた CID 実験を実行する方法およびスペクトル データを分析する方法を示しています。合成して特徴付けられる peptoid は、N 末端アセチル化、C 末端アミド化、Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2と nonamer です。Peptoid の構造を図 1に示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示プロトコルを使用して nonamer peptoid、Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2は合成されています。合成装置には、注射器のようなポリプロピレン固相反応容器と機械的シェーカーが含まれます。反応容器は商業的に低コストです。機械的シェーカーは、化学実験室で一般的な装置です。注射器のような反応容器を使って、ソリューションは引き込まれるしプランジャーを手動で移動することに?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、peptoid 合成における技術支援のため氏マイケル ・ コノリーと博士ロナルド Zuckermann (の分子鋳造、ローレンス ・ バークレー国立研究所) を感謝したいです。我々 は、全米科学財団 (チェ ・ 1301505) からの支援を認めます。パシフィック大学で化学質量分析施設ですべての質量分析実験を行った。
Materials
| ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L | Agilent Technologies Inc. | The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc. | |
| Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software | Varian Inc. | The software is a part of the Varian 320L package | |
| Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD | Fisher Scientific International Inc. | 14-400-126 | |
| Hermle Centrifuge, Model Z 206 A | Hermle Labortechnik GmbH | ||
| Solid phase reaction vessel, 10 mL | Torviq | SF-1000 | |
| Pressure caps for reaction vessels | Torviq | PC-SF | |
| Syringe filters, pore size 0.2 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3B | |
| Syringe filters, pore size 0.45 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3A | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL | VWR International, LLC. | 490001-626 | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL | VWR International, LLC. | 490001-620 | |
| ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0 | CambridgeSoft Corporation | CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc. | |
| Styrofoam cup, 12 Oz | Common Supermarket | ||
| Rink amide resin | Chem-Impex International, Inc. | 10619 | |
| Piperidine | Chem-Impex International, Inc. | 02351 | Highly toxic |
| N, N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex International, Inc. | 00110 | Highly toxic |
| Bromoacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 26843 | Highly toxic |
| 2-Phenylethylamine | VWR International, LLC. | EM8.07334.0250 | |
| 2-Methyoxyethylamine | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 241067 | |
| N-Boc-ethylenediamine | VWR International, LLC. | AAAL19947-06 | |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 252845 | |
| N, N-dimethylformamide | VWR International, LLC. | BDH1117-4LG | Further distillation before use |
| N, N-diisopropylethylamine | Chem-Impex International, Inc. | 00141 | |
| Triisopropylsilane | Chem-Impex International, Inc. | 01966 | |
| Trifluoroacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 00289 | Highly toxic |
| Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System | Millipore Corporation | ZMQP60001 | For generating HPLC grade water |
| HPLC-grade Water | Produced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System | ||
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339USP/NF | HPLC grade |
| Acetonitrile | Fisher Scientific International, Inc. | A998-4 | HPLC grade |
| Diethyl ether | VWR International, LLC. | BDH1121-19L | Further distillation before use |
| Dichloromethane | VWR International, LLC. | BDH1113-19L | Further distillation before use |
| Nitrogen gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | NIT 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
| Argon gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | ARG 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
Referências
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