JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Metodoloji balgam indüksiyon ve laboratuvar için

Published: December 17, 2017
doi:
10.3791/56612
, , , , , , , ,
1Department of Respiratory Medicine, CHU Liege, GIGA I3 Research Group,University of Liege, 2Department of Clinical Pharmacy, CIRM (Center for Interdisciplinary Research on Medicines),University of Liege

Summary

Burada biz balgam indüksiyon tekniğini tanımlamak. Bu iletişim kuralı bir fark hücre sayısı gerçekleştirmek ve balgam süpernatant toplamak için işleme balgam ve hücreleri daha fazla çözümleme için da açıklanmaktadır.

Abstract

Tanınan bir non-invaziv yöntem toplama ve astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), gibi çeşitli solunum yolu hastalıklarında ilginç Havayolları, hücrelerden analizini sağlayan tekniktir balgam indüksiyon ve işleme kronik öksürük, ya da idiyopatik Pulmoner Fibrozis. Bu teknik de toleranslı, güvenli ve non-invaziv, ama teknik olarak yüksek güç gerektiren, zaman alıcı ve eğitimli personel gerektirir çünkü klinik pratikte araştırma hizmetleri ve özel merkezleri ile şu anda sınırlı. Balgam indüksiyon ve analiz başarı oranı yaklaşık % 80 var.

Burada, balgam örnekleri indüksiyon ve laboratuvar işlenmesi açıklayın. Balgam Solunduğunda hipertonik veya izotonik salin salbutamol ile indüklenen. İşleme için biz bütün balgam çıkarma tekniği kullanın. Dithiothreitol (DTT) mucolysis balgam örneklerinin izin vermek için kullanılır. Balgam işleme birincil amacı hücre tipleri hava yolu Lümen mevcut eğitim için farklı hücre sayısı elde etmektir. Ek değerlendirmeler balgam süpernatant ve daha fazla inflamatuar süreçleri ve bağışıklık mekanizmaları üzerindeki araştırmasını izin verebilir balgam hücreleri de gerçekleştirilebilir. Arabulucu balgam süpernatant içinde eğitim ve geniş bir spektrum analizi balgam hücreleri Akış Sitometresi, genomik ve proteomik gibi performans örnekleri içerir.

Son olarak, balgam analizi sağlıklı kontrol, astımlı ve KOAH hastaları temsilcisi sonuçları sunulmuştur.

Introduction

Hava yolu iltihabı araştırmak için çeşitli yöntemler kullanılır: doğrudan (bronş biyopsi veya bronchoalveolar lavages gibi) ölçümleri ve dolaylı yöntemleri (belirti değerlendirme gibi kan örneği analiz ve akciğer fonksiyon testleri)1. Doğrudan teknikleri güvenilir havayolu inflamasyonu değerlendirme avantajı var ama invaziv ve mümkün değil, geniş ölçekli nedeniyle hasta rahatsızlık ve risk1tahakkuk. Dolaylı yöntemler gelince, onlar kötü hava yolu iltihabı1doğrudan değerlendirmesi ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir.

Balgam toplanması airways örnek hücreleri için başka bir yol olduğunu ve hava yolu iltihabı doğrudan değerlendirmesini sağlar. Yine de kendiliğinden balgam üreten kalitesiz örnekleri için neden olabilir ve tüm hastaların2için mümkün değildir. Bu sorun balgam üretim2ikna etmek için ultrasonik nebulize hipertonik salin kullanarak üstesinden gelmiştir. Bu yöntem başlangıçta insan immün yetmezlik virüsü (HIV) ile infekte hastaların emin carinii pnömoni3 tanı için kullanılmıştır ve sağlıklı ve astımlı 19924için uyarlanmıştır. İzotonik salin5kullanarak balgam indüksiyon daha ağır hastalarda Ayrıca uygulanabilirdir. Genellikle iyi tolere, serum zehirlenmesinden bronkospazm hyperresponsive airways5olan hastalarda neden olabilir, ancak. Bu nedenle, bu yordam1önce kısa etkili beta agonist yönetmek için tavsiye edilir. Ayrıca, biz daha önce ultrasonik Nebulizatör tuzlu çözümde salbutamol ekleyerek daha fazla bu riski6azalma göstermiştir. Balgam indüksiyon avantajları ise non-invaziv2 ve5uygun olduğunda güvenli önlemler alınır.

Balgam örnekleri işleme için iki yöntem şu anda literatürde kullanılır: Bütün balgam çıkarma tekniği ve fiş seçimi7. Bizim laboratuvar bütün balgam çıkarma tekniği gerçekleştirilir. Balgam işleme birincil amacı iltihap hava yolu Lümen mevcut tür çalışmaya farklı hücre sayısı elde etmektir. Ancak, birçok ek Değerlendirmeler da iltihabi süreçleri ve bağışıklık mekanizmaları, arabulucu balgam süpernatant8 okuyan tarafından veya balgam hücreleri üzerinde detaylı araştırma yaparak daha fazla araştırmak mümkündür (Örneğin , Akış Sitometresi9, hücre kültürleri10, genomik10, proteomik10, immunocytochemistry7, in situ hibridizasyon7, vb)

Şu anda teknik olarak yüksek güç gerektiren, zaman alıcı ve eğitimli personel1gerektirir çünkü araştırma hizmetleri ve özel klinik uygulama merkezlerinde sınırlı balgam indüksiyon ve analiz tekniğidir. Hava yolu iltihabı astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), kronik öksürük ya da idiyopatik Pulmoner Fibrozis11gibi çeşitli solunum yolu hastalıkları için bu yöntemi ile soruşturma olmaktır.

Protocol

Tüm yöntemleri bu bölümde açıklanan Liege Üniversitesi hastane Etik Kurulu tarafından onaylanan ve tüm sağlıklı konular katılım için yazılı onay verdi. 1. balgam indüksiyon Öncesi ve sonrası bronchodilator Spirometri Bir Spirometri gerçekleştirmek (Ekspiratuar Cilt 1 saniye içinde [FEV1] zorla ve zorla vital kapasite [FVC] manevra) Amerikan Toraks Derneği (ATS) göre / Avrupa Solunum Derneği (ERS) standart ölçütleri12. İnhale salbutamol 400 µg ölçülü doz inhaler (MDI) bir spacer aygıtı aracılığıyla yönetmek.Not: yetişkinlerde, tremor ve taşikardi13inhale salbutamol olumsuz olayları içerir. Spirometri (FEV1 ve FVC manevra) 15 dk sonra göre ATS/ERS standart ölçütleri12yineleyin. Ultrasonik Nebulizatör hazırlanmasıNot: Nebulizatör gerekir iyice temizlenmesi ve üreticinin yönergelerine uygun olarak her kullanımdan önce dezenfekte. Nebulizatör odası önerilen düzeye kadar distile su ile doldurun. Nebulizatör odası temiz bir kaba bir yer. Kupası uygun kapaklı kapağı. Kupası sonrası bronchodilator FEV1 olan bir hastam için hipertonik salin (% 5) ya da 50 mL ile doldurulması > öngörülen % 65 veya 50 mL izotonik salin (% 0,9) sonrası bronchodilator FEV1≤65% tahmin ile bir hasta için. 1,75 mL salbutamol sülfat çözeltisi (5 mg/mL) Kupası için ekleyin. Borular ve vanalar üreticinin yönergelerine uygun olarak bağlayın. Nebulization ve balgam koleksiyonuNot: Bu teknik tıbbi gözetim altında gerçekleştirin. Prosedür hastaya açıklamak. Hastanın burun kıskacı kullanmak için sor. Nebulizatör açmak ve aerosol ve fan ayarlarını en düşük düzeyini seçin. Aerosol gelgit nefesi 5 min için ağız parçası aracılığıyla nefes edilmesine sor.Not: Aerosol ve fan ayarlarını hastanın tolerans bağlı olarak artırılabilir. Dayanılmaz öksürük veya mide bulantısı, durumunda yordamı sona erdirme ve 1.3.5 adıma geçin. Göğüs sıkışması veya solunum rahatsızlık durumunda 1.3.8 adıma geçin. Nebulizatör kapat. Hasta burun kıskacı kaldırmak, ağzını suyla durulayın ve iki kez lavaboya atılmadan önce gargara sor.Not: Tükürük hücreleri balgam örneği kontamine ve kullanışsız bir örnek kurşun. Hasta balgam plastik bir kap içine kadar öksürük sor. FEV1ölçmek için bir Spirometri (zorunlu Ekspiratuar manevra) gerçekleştirin. FEV1 Güz aşağıdaki gibi değerlendirmek: (FEV1 3.8 [mL] adımda ölçülen) – (sonrası bronchodilator FEV1 ölçülen adım 1.3 [mL]) / (sonrası bronchodilator FEV1 ölçülen adım 1.3 [mL]) * 100. FEV1 veya sonrası bronchodilator değerinden daha fazla düşerse, yordamı durdurun. Ölçü FEV1 tekrar 10 dakika sonra. FEV%1 20 veya daha fazla düşerse, nebulize ipratropium bromür (0.25 mg/2 mL) yönetmek ve hastanın tıbbi gözlem altında tutmak için doktor isteyin. 1.3.10 adıma geçin. FEV1 veya sonrası bronchodilator değerinden daha fazla düşmek değil, 3.2-3,9 üç katına yineleyin 10-20 dk toplam nebulization zaman ulaşmak için.Not: Toplam nebulization zaman kalite (fişler veya yapışkan parçalar varlığı) ve balgam örnek miktarı bağlıdır. Örnek kalite ve/veya miktarı ise zavallı nebulization 10 dakika sonra yordamı bir 15-20 dk toplam nebulization zaman ulaşmak için genişletilmiş. Balgam örnek işleme kadar buzdolabında tutun. 2. balgam işleme Not: balgam örnekleme 3 saat için optimum hücre canlılığı içinde işlemek. Dikkat: bir önlük, koruyucu eldiven ve gözlük giymek. Ön hazırlıklar 10 mL üreticinin yönergelerine uygun olarak bir 6.5 mM çözüm elde etmek için steril distile su ile 10 kat seyreltme konsantre dithiothreitol çözüm (mucolytic Ajan) olun.Not: Konsantre dithiothreitol çözüm ortam havası ile karıştırma önlemek için çözüm flakon steril şırınga ve iğne ile geri alıyorum. Bir kez açıldı, konsantre çözüm şişe oda sıcaklığında muhafaza ve 5 gün içinde kullanılır. Seyreltik çözüm günlük hazırlanır.Dikkat: göz ve deri tahrişi tehlike nedeniyle koruma araçlar (giyim, eldiven ve gözlük) giymek. Trypan mavi çözüm (% 0,4) 5-fold bir seyreltme Dulbecco’nın Phosphate-Buffered serum fizyolojik (%0,08 çözümü elde etmek için DPBS ile) olun. Bu seyreltilmiş çözüm oda sıcaklığında tutmak ve 2 hafta içinde kullanın.Dikkat: kanserojen tehlike nedeniyle, koruma araçlar (giyim, eldiven ve gözlük) giymek. Balgam süpernatant topluluğu 50 mL konik alt plastik tüp içinde bütün balgam aktarmak ve örnek tartın. 3 kat ağırlığını DPBS çözüm ekleyin. Yavaş yavaş girdap örnek 30 s. Santrifüj vasıl 800 x g ve 4 ° C’de 10 dakika için. Steril gazlı bez 2 tek katmanı üzerinden örnek filtre ve süpernatant 50 mL konik alt plastik tüp içinde toplamak. Aliquot süpernatant 2 mL plastik tüpler ve onları-80 ° C’de depolayınNot: Süpernatant örnekleri balgam sıvı faz bileşenlerini tahlil yararlıdır. Balgam Mucolysis Gerekirse, DPBS 5 mL süspansiyon hücre toplam hacmi ulaşmak için hücre Pelet ekleyin. 6.5 mM dithiothreitol 1 hacmi ile hücre süspansiyon sulandırmak. Bir tezgah rocker hücre süspansiyon için oda sıcaklığında 20 dk rock için kullanın. DPBS ile en az 3 kez tekrarlayın. Seyreltilmiş hücre süspansiyon, 550 x g ve 4 ° C’de 10 dakika santrifüj kapasitesi.Süpernatant atmak. Hücre Pelet DPBS yaklaşık 1 mL resuspend. Nitel özellikleri hemasitometre sayı balgam örneği (hücre konsantrasyonu, Skuamöz hücreli kirlenme ve canlılığı Trypan mavi dışlama yöntemi tarafından) değerlendirilmesi Değerlendirmek ve hücre süspansiyon tam ses kaydedebilirsiniz. Homojenize ve hücre süspansiyon 50 µL %0,08 trypan mavi çözüm 50 µL için ekleyin. Örnek bir hemasitometre (Thoma odası) coverslip altında koymak ve optik mikroskop altında (400 X) yerleştirin. Skuamöz Hücre, canlı olmayan Skuamöz hücreler (tutamaçlarından hücresi) ve ölü Skuamöz Hücre sayısı (mavi renkli hücreleri).Not: Durumunda çok düşük veya çok yüksek hücre yoğunluğu, konsantre veya hücre süspansiyon sulandırmak ve adımları 2.4.1-2.4.3 tekrarlayın. Süspansiyon, Skuamöz Hücre yüzdesi ve canlılığı sigara Skuamöz Hücre yüzdesi hücre konsantrasyonu değerlendirmek.Not: Toplam sigara Skuamöz Hücre sayısı/g, balgam hesaplamak: hücre süspansiyon (Adım 5,4) konsantrasyon * birim hücre süspansiyon (Adım 4.8) * % sigara Skuamöz Hücre / kilo balgam örneği (Adım 2.2.1). Lekeli cytospin hazırlanması slayt hücre süspansiyon ve depolama kalan hücrelerin ile gerekirseNot: % 80’den fazla Skuamöz Hücre süspansiyon içeriyorsa, hücreleri, örnek olarak kabul edilir yoksul kaliteli ve uygun olmayan bir cytospin slayt14. Bu durumda, işlem sona erdirme ve bu örnek başarısız düşünün. Hücre süspansiyon hücre süspansiyon 500.000 hücre/mL, en az 350 µL elde etmek için DPBS ile bir aliquot oranında seyreltin. Hücre yoğunlaştırıcı üreticinin yönergelerine uygun olarak bir araya getirin. Her hücre yoğunlaştırıcının 3 bölmeleri bu hücre süspansiyon 100 µL ile doldurun. Bir cytocentrifuge içinde vasıl 150 x g ve oda sıcaklığında 2 min için spin. Supernatants atın. Üreticinin yönergelerine uygun olarak hücre yoğunlaştırıcı sökmeye. Slayt hava kuru izin.Not: Bu aşamada, kalan hücreleri yeterli bir arabellekte daha fazla deneyler için gerekli saklanabilir. Bir ticari boyama ile slayt Kiti (bkz. Tablo reçetesi) üretici yönergelerine uygun olarak leke. Slayt uygun montaj orta ve kapak kayma ile bağlayın. Slayt yağı daldırma ile optik mikroskop (600 X) altında yerleştirin. En az 500 Skuamöz olmayan hücreleri saymak: nötrofiller, eozinofiller, makrofajlar, lenfositler ve epitel hücreleri.Not: Farklı hücre sayısı genellikle tek kişi tarafından yapılır veya iki adanmış ve gözlemciler interobserver farklılıklar sınırlamak için eğitilmiş. Kayıt mutlak değerler ve her hücre türü yüzdeleri.

Representative Results

HemasitometreTipik bir görüntü hemasitometre kullanarak mikroskopla görselleştirildiği şekil 1 ‘ deki gösterilir. Daha sigara Skuamöz Hücre daha büyük olduğu gibi Skuamöz hücreler kolayca tanımlanır. Bu Skuamöz epitel hücreleri ağzından gelen hücrelerdir. Her iki tip hücre Trypan mavi zaman ölü lekeli. Dikkat, Maya, bakteri ve hurda sayma önlemek için alınmalıdır. Resim 1 : (A) bir yaşam sigara Skuamöz hücreli, (B) bir ölü Skuamöz hücreli ve (C) bir Skuamöz Hücre gösteren hemasitometre resim. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Cytospin slayt: Şekil 2 temsilcisi bir balgam işlendikten sonra elde edilen bir cytospin slayt görüntüsünü gösterir. Farklı hücre tipleri (nötrofiller, eozinofiller, makrofajlar, lenfositler ve epitel hücreleri) onların morfolojisi ve renklendirme ile farklı. Bazı durumlarda, kirlenme Skuamöz hücreler tarafından önemli olabilir ve Skuamöz Hücre yüzdesi % 80’den büyük ise, başarısız (şekil 3) örnek olarak kabul edilir. Resim 2 : (A)bir nötrofil, (B) bir makrofaj, (C) bir eozinofil, (D) bir lenfosit gösteren Cytospin slayt resim ve (E) bir epitel hücre. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : Kalitesiz cytospin slayt ile örnek > Skuamöz Hücre. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Başarı oranıKliniğimizde, başarı oranı (başarılı bir indüksiyon ve okunabilir bir cytospin birleştirerek) prosedürün 1129 hasta (sağlıklı, astımlı veya KOAH hastaları) bir örneği temel alarak, (924/1.129). Hastalar türüne göre bir alt analizi, başarı (57/76) sağlıklı bireylerde % 75, (827/1,004) astımlı ve KOAH hastalarında % 82 ‘ (40/49) oranıdır. Sağlıklı bireylerde sonuçlarıRetrospektif bir analiz departmanımız, medyan (interquartile Aralık) 289 sağlıklı konularında bir dizi içinde balgam ağırlık 3.72 g (interquartile aralığı, 2,46 g – 5,54 g) ve ortalama toplam sigara Skuamöz Hücre sayısı/g balgam, 106 () x 0.59 oldu 0,37 x 10 interquartile aralığı6 – 1.29 x 106). Bu sağlıklı bireylerde (% 10-) Skuamöz Hücre oranı düşüktür ve canlılığı (54-) yüksektir. Farklı hücre tipleri yüzdesi ile ilgili sonuçları şekil 4Aözetlenir. Makrofajlar ( [31-]) yüzdesi nötrofil ( [% 14-]), lenfositler (%2 [% 1-3]) oranlarda iken yüzdesi daha yüksek, eozinofil (%0 [% 0-%0]) ve epitel hücreleri (%4 [2-]) düşüktür gözlemleyebilirsiniz. Bu sonuçlar benzer olduğunda veri mutlak değerler (şekil 4B) ifade edilir. Şekil 4 : (A)yüzdeleri veya (B) mutlak değerler olarak ifade edilen sağlıklı bireylerde gözlenen fark hücre sayısı temsilcisi sonuçları. Sonuçları medyan (interquartile Aralık) gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Hastaların yaş dikkate almak önemlidir. Gerçekten de, güçlü bir korelasyon balgam örnekleri (şekil 5) hastanın yaş ve nötrofil oranı arasında mevcuttur. Aynı şekilde, ne zaman hastalar 10 yıl yaş gruplarına (şekil 6) göre sınıflandırılması, biz nötrofil oranı artan yaş grubu ile önemli bir artış görülmektedir. Bu nedenle, bu değişken farklı tabur sonuçları karşılaştırırken dikkate alınmalıdır ve dikkat konuları tam olarak alınmalıdır. Şekil 5: Yaş ve balgam nötrofil yüzde arasında korelasyon. Korelasyon hesaplanmıştır Spearman testi ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 6: Yaş kategorisine göre nötrofil yüzde evrimi. ANOVA p değeri < 0,0001 nötrofil yüzde yaş sınıfları arasında karşılaştırma için. Birden fazla karşılaştırmalar Dunn’ın birden fazla karşılaştırma testi ile yapılmıştır. P değerleri aşağıdaki gibi gösterilir: * p < 0,05, ** p < 0,01, ve *** p < 0,001. Sonuçları medyan (interquartile Aralık) gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Hastalarda solunum yolu hastalıkları sonuçlarındaİndüklenen balgam çıkarma tekniği astımlı hastalarda inflamatuar hücre profil değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır.Bu teknik aynı zamanda KOAH, başka bir enflamatuar solunum hastalığı muzdarip hastalara uygulanabilir. Sağlıklı, astımlı ve KOAH hastaları (yaş, cinsiyet ve tütün alışkanlıkları için eşleşen 3 grup) karşılaştırırken, inflamatuar hücre profili oldukça bu tabur (Şekil 7) arasında farklıdır görülmektedir. Balgam nötrofil oranı genellikle KOAH hastalarında sağlıklı kontrollere göre daha yüksek ise gerçekten, astım hastaları genellikle yükseltilmiş balgam eozinofil tarafından hangi hastalık şiddeti bağlı olduğu ile karakterizedir. Şekil 7 : Balgam inflamatuar hücre profil sağlıklı deneklerin (n = 45), astım hastaları (n = 108) ve KOAH hastaları (n = 54). Üç grup cinsiyet, yaş ve tütün alışkanlıkları için eşleştirilmiş. ANOVA p değerleri vardı < 0,05, < 0,0001, ve < 0,0001 nötrofiller, eozinofiller ve makrofajlar gruplar arasında karşılaştırılması için sırasıyla. Birden fazla karşılaştırmalar Dunn’ın birden fazla karşılaştırma testi ile yapılmıştır. P değerleri aşağıdaki gibi gösterilir: * p < 0,05 ve *** p < 0,001. Sonuçları medyan (interquartile Aralık) gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

İndüklenen balgam çıkarma yöntemi hava yolu bölme eğitim için yararlı bir araçtır. Bu teknik birkaç olası uygulama vardır. İlk olarak, bağışıklık hücreleri ve mekanizmaları çeşitli solunum yolu hastalıkları yer hakkında bilgi artırabilir. Örneğin, bu teknik içinde hastaların büyük tabur hava yolu iltihabı incelenmesi izin verdi ve astım hastaları yaklaşık yarısı bir anormal hava yolu Eozinofilik iltihap15tarafından, ile karakterize gösterilmiştir 16 , KOAH hastaları genellikle yükseltilmiş balgam nötrofil sergiler Ise 17,18saymak. Bu teknik aynı zamanda daha iyi hava yolu iltihabı idiyopatik Pulmoner Fibrozis olan hastalarda karakterizasyonu ve bu hastalığı19‘ a katkıda bulunabilir kanıt arabulucu katkıda bulunmuştur. İkinci olarak, indüklenen balgam çıkarma tekniği tedaviye yanıt tahmin etmek yararlı olabilir. Örneğin, balgam eozinofil anormal bir yüzdesi varlığı kortikosteroid yanıt verme hızını11,18akýllý bir marker olduğu gösterilmiştir. Astım ve KOAH, balgam eozinofil yüzdesi normalleştirmek için kortikosteroid doz terzilik tedavi mevcut klinik kurallar11 göre ayarlama daha exacerbations sayısını azaltmada daha etkili olduğu gösterilmiştir ,20,21. Üçüncü olarak, balgam analiz hedefli tedaviler geliştirmek için yardımcı olabilir. Örneğin, KOAH ve astım hastaları balgam nötrofil sayısı anormal bir varlığı antineutrophilic tedaviler11gelişmesine yol açmıştır. Dördüncü olarak, teknik tanıda bir rol oynayabilir. Örneğin, balgam Granülom varlığı olmayan astımlı Eozinofilik bronşit11tanı yapmak gereklidir.

Farklı hücre sayısı almak yanı sıra, balgam inducing tekniği de birçok ek Değerlendirmeler, performansını balgam süpernatant veya balgam hücreleri okuyan tarafından sağlanır. Arabulucu8,19,22 analiz ve değerlendirme örnek eozinofil22için kemotaktik etkinliğinin örnekler balgam süpernatant ile. Balgam hücrelerden RNA çıkarılan ve mikroRNA için kullanılan veya gen ekspresyonu19,23 inceliyor. Balgam hücreleri de, diğerleri arasında immunophenotyping ve hücreleri sıralama sağlar Akış Sitometresi9,23 tarafından analiz edilebilir. Ayrıca, balgam hücreler kültürlü10olabilir ve arabulucu üretim ölçülen vitro24olabilir. Bu durumda fazlalaştı, arabulucu içerik ne balgam içinde süpernatant bulunabilir farklıdır. Nitekim, balgam süpernatant arabulucu salgıları hava yolu ikamet hücrelerden ve balgam hücre kültür model24aksine plazma reaksiyon tarafından etkilenebilir. Son olarak, immunocytochemistry ve in situ hibridizasyon da balgam hücreleri7kullanarak gerçekleştirilebilir.

İndüklenen balgam teknik bazı sınırlamalara sahiptir. İndüksiyon tıbbi gözetim altında gerçekleştirilmelidir. Bu da hastalar için ayrıntılı talimatlar verir işleç için esastır. Solunum çabaları gerektiğinde işbirliği ve hastaların, sağlık durumu diğer sınırlamaları içerir. Çocuklarda bu Teknik fizibilite ile ilgili çeşitli çalışmalarda başarılı ve güvenli çocuklarda 6 yaşında25daha büyük olduğunu bildirdi. Çocuklar üzerinde veri < 6 yaşın25eksik, ama büyük olasılıkla balgam indüksiyon o çocuk14‘ te yapmak zor olduğunu. Teknik araştırma hizmetleri ve özel merkezleri bu teknik olarak yüksek güç gerektiren, zaman alıcı ve eğitimli personel1gerektirir çünkü şu anda olamaz. Balgam indüksiyon ve analiz tekniği her zaman başarılı, okunabilir bir cytospin her zaman26elde değil anlam değil başka bir kısıtlamadır. Ancak, başarı oranı genellikle hastalar4,26,27,28,29farklı tabur % 80 civarındadır. Son olarak, ne zaman karşılaştırma ile ilgili yaş eşleşen balgam hücre sayısı30,31çarpışmaya gösterildiği hastaların farklı tabur dikkat alınmalıdır. Aynı şekilde, toplumsal cinsiyet ve tütün alışkanlıkları gibi diğer parametreleri olarak onlar da ile balgam hücre sayısı29,32engelleyebilir uyumlu olması gerekiyor. Hasta eşleşen mümkün olmadığında, yaşı, cinsiyeti ya da yasaktır durumu dikkate almak için başka bir istatistiksel analiz için bu özellikleri ayarlamak için yoludur.

Havayolları, biyopsi ve bronchoalveolar lavages, gibi gelen hücre toplama sağlar diğer teknikleri ile karşılaştırıldığında indüklenen balgam çıkarma yöntemi basit, iyi tolere, güvenli, tekrarlanabilir, düşük maliyetli ve non-invaziv olmanın avantajı vardır. Bu avantajları büyük ölçüde ve art arda zaman içinde gerçekleştirilecek indüklenen balgam çıkarma tekniği izin ve hava yolu örnekleme için tercih edilen bir alternatif yapmak. Bronchosorption hava yolu arabulucu33değerlendirmek amacıyla Mukozal astar sıvı toplanmasını sağlayan bir tekniktir. Bu teknik (gerektiren Bronkoskopi) indüklenen balgam daha daha invaziv olmakla birlikte, tükürük ile herhangi bir bulaşma kaçınmak ve arabulucu bronchoalveolar lavaj33içinde daha yüksek konsantrasyonlarda alma avantajları vardır.

Kritik adımlar protokolündeki dinlesin. İlk olarak, bu iki parametre sonuçları etkiler ve bu nedenle standart34,35olmak zorunda çünkü tuz konsantrasyonu ve indüksiyon, zaman ile ilgili dikkatli alınmalıdır. İkinci olarak, mucolysis DTT ile işleme önemli bir adımdır. PBS ile karşılaştırıldığında, DTT daha iyi cytopsin slayt kalitesini artırır ve tekrarlanabilir hücre sayısı2olması esastır balgam hücreleri7, hangi dağıtmak için gösterildi. Ancak, mucolytic Ajan biyokimyasal bileşenleri ölçüm ile girişime neden olabilir.Deneyler spiking sonra ne zaman yeni bir biyokimyasal bileşik36ölçme yapılmalıdır. Son olarak, başka bir önemli adım yordam yorumlanabilir ve güvenilir sonuçlar alabilmek için eğitimli bir teknisyen tarafından gerçekleştirilmesi gereken adım sayma hücredir.

Yerine tüm balgam, balgam prizler (parçalar) yılanının veya daha yoğun, kullanarak alternatif bir yöntem edebiyat7‘ de açıklanmıştır. Her iki teknik avantajları ve dezavantajları vardır. Bütün balgam çıkarma tekniği daha fazla hızlı7işleme izin verir ama sık sık örnek sulandırır ve cytospins2,7kalitesini düşürebilir tükürük ile kirlenmiş durumda. Tak seçim tekniği ile tükürük kirlenme azaltılmış örnekleri sık sık daha iyi kalite için sıvı faz arabulucu doz ve cytospin slayt7için olduğu anlamına gelir. İşlem ancak daha uzun7 ve seçili fiş tüm örnek37temsilcisi olmayabilir. Bu da tüm örnekleri sınırlama bujileri içeren dikkati çekiyor. Her iki yöntem doğrulanmış ve tekrarlanabilir ve şu anda her iki yöntem elde edilen fark hücre sayısı farklı14,38olduğunu hiçbir kanıt yoktur.

Gelecekte, indüklenen balgam klinik bir araç olarak Biyolojik araştırma, tanı ve yönetim inflamatuar solunum yolu hastalıkları her türlü sağlamak için kullanılabilir.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Üniversitesi Hastanesi, Liege tarafından (CHU Liege) destek verdi. “Instants üretimler” video üretimi için anıyoruz. Ayrıca Cedric François,’adlı filmde hasta anıyoruz.

Materials

Spirometer – Spirobank MIR France
Salbutamol MDI – Ventolin GLAXOSMITHKLINE CNK: 0135-913 See drug available in the country
Nebulizer UltraNeb DeVilbiss Healthcare USA UltraNeb U3000
Devilbiss UltraNeb Disposable Cups & Lids DeVilbiss Healthcare USA 100HD-647
DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers DeVilbiss Healthcare USA 1001005879
One-way Valves Hudson RCI USA 41664
One-way Valves Hudson RCI USA 41665
Aerosol T-connector  Hudson RCI USA 41077
Ventilation circuit monobranch corrugated Int'Air Medical France TA30A
NaCl 5 %  / / Produced by our hospital pharmacy
Mini-Plasco NaCl 0.9% B.Braun Medical  Diegem Belgium
Salbutamol sulfate 5 mg/mL – Ventolin GLAXOSMITHKLINE CNK: 0094-987 See drug available in the country
Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL – Atrovent Boehringer Ingelheim Germany CNK: 1543-305 See drug available in the country
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline LONZA Belgium BE17512F
Sputolysin reagent Calbiochem 56000
Trypan blue 0.4% solution 100 mL LONZA Bio Whittaker Belgium 17-942E
Hemocytometer – Thoma chamber Labor Optik Lancing UK 1500000
Hemacolor Stainig set Merck Belgium 1116610001 Alternative product  : Diff Quik Staining Set
 Medion Diagnostic 
Mounting medium – Entellan Merck Belgium 107960
Statspin Cytofuge 12  Beckman Coulter Belgium X00-003066-001
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice. European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).
  2. Pavord, I. D., Pizzichini, M. M., Pizzichini, E., Hargreave, F. E. The use of induced sputum to investigate airway inflammation. Thorax. 52 (6), 498-501 (1997).
  3. Leigh, T. R., et al. Sputum induction for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. The Lancet. 334 (8656), 205-206 (1989).
  4. Pin, I., et al. Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma. Thorax. 47 (1), 25-29 (1992).
  5. Pizzichini, M. M. M., Leigh, R., Djukanović, R., Sterk, P. J. Safety of sputum induction. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 9s-18s (2002).
  6. Delvaux, M., et al. Nebulised salbutamol administered during sputum induction improves bronchoprotection in patients with asthma. Thorax. 59 (2), 111-115 (2004).
  7. Efthimiadis, A., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 19s-23s (2002).
  8. Kelly, M., et al. Analysis of fluid-phase mediators. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 24s-39s (2002).
  9. Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
  10. Vignola, A. M., et al. Future directions. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 51s-55s (2002).
  11. Brightling, C. E. Clinical applications of induced sputum. Chest. 129 (5), 1344-1348 (2006).
  12. Miller, M. R. Standardisation of spirometry. European Respiratory Journal. 26 (2), 319-338 (2005).
  13. Szefler, S. J., et al. Asthma outcomes: biomarkers. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3 Suppl), S9-S23 (2012).
  14. Douwes, J., Gibson, P., Pekkanen, J., Pearce, N. Non-eosinophilic asthma: importance and possible mechanisms. Thorax. 57 (7), 643-648 (2002).
  15. Schleich, F. N., et al. Importance of concomitant local and systemic eosinophilia in uncontrolled asthma. The European Respiratory Journal. 44 (1), 97-108 (2014).
  16. Demarche, S., et al. Detailed analysis of sputum and systemic inflammation in asthma phenotypes: are paucigranulocytic asthmatics really non-inflammatory?. BMC pulmonary medicine. 16, 46 (2016).
  17. Pavord, I. D., et al. Clinical applications of assessment of airway inflammation using induced sputum. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 40s (2002).
  18. Guiot, J., Henket, M., Corhay, J. L., Moermans, C., Louis, R. Sputum biomarkers in IPF: Evidence for raised gene expression and protein level of IGFBP-2, IL-8 and MMP-7. PLOS ONE. 12 (2), e0171344 (2017).
  19. Green, R. H., et al. Asthma exacerbations and sputum eosinophil counts: a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9347), 1715-1721 (2002).
  20. Siva, R., et al. Eosinophilic airway inflammation and exacerbations of COPD: a randomised controlled trial. European Respiratory Journal. 29 (5), 906-913 (2007).
  21. Louis, R., et al. Cell infiltration, ICAM-1 expression, and eosinophil chemotactic activity in asthmatic sputum. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 466-472 (1997).
  22. Maes, T., et al. Asthma inflammatory phenotypes show differential microRNA expression in sputum. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1433-1446 (2016).
  23. Moermans, C., et al. Local and systemic cellular inflammation and cytokine release in chronic obstructive pulmonary disease. Cytokine. 56 (2), 298-304 (2011).
  24. Gibson, P. G., et al. Sputum induction in children. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 44s-46s (2002).
  25. Reddel, H. K., et al. An Official American Thoracic Society/European Respiratory Society Statement: Asthma Control and Exacerbations: Standardizing Endpoints for Clinical Asthma Trials and Clinical Practice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 180 (1), 59-99 (2009).
  26. Duncan, C. J. A., Lawrie, A., Blaylock, M. G., Douglas, J. G., Walsh, G. M. Reduced eosinophil apoptosis in induced sputum correlates with asthma severity. The European Respiratory Journal. 22 (3), 484-490 (2003).
  27. Demarche, S. F., et al. Asthma Control and Sputum Eosinophils: A Longitudinal Study in Daily Practice. The Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 5 (5), 1335-1343 (2017).
  28. Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2 Pt 1), 475-478 (2000).
  29. Brooks, C. R., Gibson, P. G., Douwes, J., Dalen, C. J. V., Simpson, J. L. Relationship between airway neutrophilia and ageing in asthmatics and non-asthmatics: Airway neutrophilia and ageing. Respirology. 18 (5), 857-865 (2013).
  30. Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
  31. Chalmers, G. W., et al. Smoking and airway inflammation in patients with mild asthma. Chest. 120 (6), 1917-1922 (2001).
  32. Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma: Increased Interferons (IFN-γ and IFN-λ) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. 19, 128-138 (2017).
  33. Popov, T. A., et al. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis). European Respiratory Journal. 8 (4), 559-565 (1995).
  34. Holz, O., et al. Changes in sputum composition between two inductions performed on consecutive days. Thorax. 53 (2), 83-86 (1998).
  35. Louis, R., et al. The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum. European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).
  36. Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects. American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
  37. Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination. The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).

Tags

Sputum InductionInduced SputumAirway DiseasePulmonary FibrosisNon-invasiveSpirometryBronchodilatorsHypertonic SalineIsotonic SalineSalbutamolNebulizerMedical SupervisionTidal Breathing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Guiot, J., Demarche, S., Henket, M., Paulus, V., Graff, S., Schleich, F., Corhay, J., Louis, R., Moermans, C. Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing. J. Vis. Exp. (130), e56612, doi:10.3791/56612 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image