喀痰誘発および実験室の処理のための方法論

このセクションで説明するすべてのメソッドは、リエージュ大学病院の倫理委員会によって承認されているし、すべての健常者が参加の書面によるインフォームド コンセントを与えた。 1. 喀痰誘発 前と後の気管支拡張剤のスパイロメトリー スパイロメトリーを実行 (1 秒 [fev 社1] の強制 expiratory ボリュームと肺活量 [FVC] 操縦) アメリカ胸部学会 (ATS) によると/欧州呼吸器学会 (ERS) 標準条件12。 スペーサー デバイスを介してメーター用量吸入器 (MDI) から 400 μ g 吸入サルブタ モールを管理します。注: 大人、吸入サルブタ モールの有害事象は振戦、頻脈の13を含みます。 スパイロメトリー (fev 社1と FVC 操縦) 15 分後で繰り返す、ATS/ERS 基準12によると。 超音波ネブライザーの準備注意: ネブライザーする必要があります徹底的に洗浄・消毒製造元の指示に従い、各使用する前に。 推奨レベルまで蒸留水でネブライザー室を埋めます。 ネブライザー室にクリーン カップを置きます。 適切なふた付きカップをカバーします。 後気管支拡張剤 fev 社1患者の高張生理食塩水 (5%) のいずれかの 50 mL のカップを埋める > 65% 予測または 50 mL の等張生理食塩水 (0.9%) 後気管支拡張剤 fev 社1≤65% 予測患者の。 カップにサルブタ モール硫酸塩溶液 (5 mg/mL) の 1.75 mL を追加します。 チューブとバルブ製造元の指示に従って接続します。 ネブライザーと喀痰のコレクション注: は、医療監督の下で技術を実行します。 患者への手順を説明します。 鼻クリップを使用する患者をお願いします。 噴霧器をオンし、エアロゾルとファンの設定の最下位のレベルを選択します。 5 分の呼吸法とマウスピースを介してエアロゾルを吸入する患者をお願いします。注: 患者の耐性に応じてエアロゾルとファンの設定を増加可能性があります。 耐え難い咳や吐き気、場合の手順を中止し、1.3.5 の手順に進みます。 胸の圧迫感や呼吸苦、1.3.8 のステップに移動します。 噴霧器をオフにします。 鼻クリップを削除し、水で口をすすぎ、シンクにそれを破棄する前に 2 回うがい患者をお願いします。注: 唾液細胞が痰のサンプルを汚染して使用できなくなるサンプルに 。 プラスチックの容器に痰を咳をする患者をお願いします。 Fev 社1を測定するスパイロメトリー (強制呼出) を実行します。 Fev 社1秋を次のように評価: (fev 社1は 3.8 [mL] のステップで測定される) – (1.3 [mL] のステップで測定後気管支拡張剤 fev 社1 )/(1.3 [mL] のステップで測定後気管支拡張剤 fev 社1 ) * 100。 Fev 社1後気管支拡張剤値から 20% 以上該当する場合は、手順を中止します。Fev 社1再び 10 分後を測定します。Fev 社1には、20% 以上が該当する場合は、噴霧イプラトロピウム臭化物 (0.25 mg/2 mL) を管理し、医療観察下の患者に医師を求めます。1.3.10 手順に進みます。 Fev 社1が後の気管支拡張剤の値から 20% 以上でない場合、手順 3.2 〜 3.9 1 ~ 3 回 10 〜 20 分の合計ネブライザー時間に到達します。注: 合計ネブライザー時間は痰のサンプルの量と質 (プラグまたは粘性部品の存在) になります。サンプルの質や量が悪い場合ネブライザーの 10 分後、手順を拡張して、15 〜 20 分の合計ネブライザー時間に到達する必要があります。 冷蔵処理まで痰のサンプルを保ちます。 2. 喀痰処理 注: 最適な細胞生存率のサンプリングの 3 時間以内、喀痰を処理します。 注意: は、白衣、防護手袋、ゴーグルを着用します。 予備の準備 滅菌蒸留水 10 mL を製造元の指示に従って、6.5 ミリメートルのソリューションを取得する集中ジチオトレイトール ソリューション (粘液溶解剤) の 10 倍希釈を行います。注: 集中ジチオトレイトール ソリューション周囲の空気との混合を防ぐために、ソリューションから撤退バイアル滅菌注射器と針で。開いたら、濃縮液バイアルを室温で保管し、5 日以内に使用する必要があります。希釈した溶液を毎日用意しています。注意: 目や皮膚の炎症の危険性のため保護具 (衣類、手袋とゴーグル) を着用します。 ダルベッコ Phosphate-Buffered 生理食塩水 (DPBS) 0.08% 解を得るためトリパン ブルー溶液 (0.4%) の割増希釈を行います。この希釈液を室温で維持し、2 週間以内に使用します。注意: 発癌性の危険のため保護具 (衣類、手袋、ゴーグル) を着用します。 喀痰培養上清のコレクション 50 mL コニカル下部のプラスチック製のチューブで全体の喀痰を転送し、サンプルの重量を量る。 DPBS ソリューションの 3 倍の重量を追加します。 ゆっくりと渦 30 サンプル s。 遠心 800 x g、4 ° C で 10 分間します。 滅菌ガーゼの 2 層を通して試料をフィルター処理し、50 mL コニカル下部のプラスチック製のチューブに上清を収集します。 分注 2 mL プラスチックの上澄みチューブ、-80 ° C で保存注: 清サンプル、喀痰流体相コンポーネントを試金するために役立ちます。 喀痰孟 必要に応じて、細胞懸濁液 5 mL の容量に到達する細胞ペレットに DPBS を追加します。 6.5 mM ジチオトレイトールが 1 つのボリュームに細胞懸濁液を希釈します。ベンチ ロッカーを使用して、室温で 20 分間細胞懸濁液をロックします。 DPBS と少なくとも 3 回を繰り返します。 550 x g と 10 分のための 4 ° C で希釈した細胞懸濁液を遠心します。上清を捨てます。 DPBS 約 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。 検定数によって痰のサンプル (細胞濃度、扁平上皮細胞の汚染、トリパン ブルー排除法による生存率) の質的特性の評価 評価し、細胞懸濁液の正確な量を記録します。 0.08% トリパン ブルー溶液を 50 μ l 添加に細胞懸濁液 50 μ L を追加し、均質化します。 検定 (トーマ部屋) の coverslip の下でサンプルを入れて光学顕微鏡 (400 倍) の下に置きます。 扁平上皮細胞、非扁平上皮細胞 (未塗装細胞) と死んで非扁平上皮細胞を数える (青色塗装のセル)。注: 場合低すぎるか高すぎる細胞密度、集中し、または細胞懸濁液を希釈、手順 2.4.1-2.4.3 を繰り返します。 細胞濃度懸濁液、扁平上皮細胞の割合、非扁平上皮癌細胞の割合を評価します。注: 計算結果喀痰の総非扁平上皮細胞数/g: 細胞懸濁液 (ステップ 5.4) の濃度 * 細胞懸濁液 (ステップ 4.8) のボリューム * % 非扁平上皮細胞の/重量の痰のサンプル (ステップ 2.2.1)。 ステンド グラス cytospin の準備が必要な場合細胞懸濁液の残留細胞のストレージとスライドします。注: 細胞懸濁液に扁平上皮癌の 80% 以上が含まれている場合サンプルのセルと見なされます貧しい品質と cytospin スライド14には不向き。その場合は、処理を中断し、失敗したこのサンプルを検討します。 細胞懸濁液 500,000 セル/mL の細胞懸濁液の少なくとも 350 μ L を取得する DPBS の因数を希釈します。 製造元の指示に従って、セルのコンセントレーターを組み立てます。 この細胞懸濁液を 100 μ l 添加でセル コンセントレーターの 3 コンパートメントの各を入力します。 収集で 150 x g と常温で 2 分間スピンします。培養上清を捨てます。 製造元の指示に従って、セルのコンセントレーターを逆アセンブルします。 乾燥空気にスライドを許可します。注: この段階で残留セル格納できます十分なバッファー内のさらなる実験に必要な場合。 商業染色スライド キット (材料の表を参照)、製造元の指示に従って汚れ。 メディアを適切なマウントとカバー スリップ、スライドをマウントします。 オイルの液浸と光学顕微鏡 (600 X) の下でスライドを配置します。 少なくとも 500 の非扁平上皮細胞をカウント: 好中球、好酸球、マクロファージ、リンパ球、上皮細胞。注: 差動細胞数は通常 1 つだけが実行または 2 つは専用判定不一致を制限するオブザーバーを訓練を受けた。 レコードの絶対値と各セルのパーセンテージを入力します。