Oppdagelse og fjerning av Nuclease forurensning under rensing av rekombinant Prototype skummende Virus Integrase
Summary
Rekombinant prototype skummende virus integrase protein er ofte forurenset med en bakteriell nuclease under renselsen. Denne metoden identifiserer nuclease forurensning og fjerner den fra den siste forberedelsen av enzymet.
Abstract
Integrase (IN) protein av retrovirus prototype skummende viruset (PFV) er en modell enzymet for å studere mekanisme retroviral integrering. PFV i forhold til IN fra andre retroviruses, og er mer løselig og mer mottakelig for eksperimentell manipulasjon. I tillegg er det følsom for klinisk relevante humant immunsviktvirus (HIV-1) IN hemmere, antyder at PFV i katalytisk mekanisme er lik at av HIV-1 IN. IN katalyserer kovalente sammenføyning av viral komplementære DNA (cDNA) mot DNA i en prosess kalt strand overføring. Denne strand overføring reaksjonen introduserer kutt til målet DNA. Analyse av integrasjon reaksjon produkter kan bli forvirret av tilstedeværelsen av nucleases som tilsvarende nick DNA. En bakteriell nuclease har vist å co rense med rekombinant PFV IN uttrykt i Escherichia coli (E. coli). Her beskriver vi en metode for å isolere PFV i fra forurensende nuclease av heparin affinitet kromatografi. Fraksjoner er lett vist for nuclease kontaminering med supercoiled plasmider og agarose gel geleelektroforese. PFV i og forurensende nuclease viser alternative slektskap for heparin sepharose slik at en nuclease uten forberedelse av rekombinant PFV i egnet for bulk biokjemiske eller ett molekyl analyse av integrering.
Introduction
Biokjemiske og ett molekyl studier av protein interaksjoner med DNA krever eksepsjonelt ren rekombinante proteinene. Forurensende nucleases fra bakterier kan skjule resultatene av disse analyser. En forurensende nuclease har blitt funnet i forberedelsene rekombinante proteinene oksygen scavenger protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) og prototype skummende virus (PFV) integrase (IN) isolert fra Escherichia coli (E. coli)1 , 2 , 3.
Retroviral integrering analyser stole på konvertering av supercoiled DNA nicked eller lineær produkter som et mål i aktivitet4. Under cellular infeksjon blir IN de to endene av en viral cDNA til verten chromatin5. Hver ende med reaksjon kalles strand overføring. Analyser av rekombinant IN aktivitet kan delta to DNA oligomers etterligne viral cDNA ender til et mål DNA i et felles integrering reaksjon4,5,6,7,8. Alternativt kan rekombinant IN bli en DNA ende i en ikke-fysiologisk relevant halv område integrering reaksjon9,10. Når supercoiled plasmider DNA er målet for integrering, felles integrering produkter er linearized DNA og halv området integrering produkter avslappet sirkler. Produktene reaksjon identifiseres av deres relative mobilitet under agarose gel geleelektroforese1. Hvis rekombinant inn har en forurensende nuclease, vil det være falske avslappet sirkler eller en muligens linearisert plasmider forvirrende eksperimentelle resultatene. Viral DNA oligomers kan være fluorescently merket som entydig identifiserer integrering produkter, i motsetning til nuclease produkter. Imidlertid favoriserer i stor grad supercoiled DNA mål; tap av supercoiled plasmider avslappet sirkler eller lineær DNA av forurensende nuclease kan forskyve resultatene og tolkning av data11. Derfor er det viktig å fjerne bakteriell nucleases fra retroviral i forberedelsene.
PFV i har en annen affinitet for heparin sepharose sammenlignet med bakteriell nuclease1. PFV på og av nuclease kan skilles med en lineær gradient elueringsrør fra heparin sepharose. Nuclease er ikke lett oppdaget av en ultrafiolett (UV) absorbans ved 280 nm topp eller analytisk natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side). I stedet oppdages nuclease av en nuclease aktivitet analysen ansette konvertering av en supercoiled plasmider avslappet sirkler eller lineær produkter. Hver fraksjon etter heparin sepharose kromatografi er testet for nuclease aktivitet. PFV i og miljøgifter til nuclease har ingen forskjell i affinitet for Mono-Q anion harpiks. Det er en liten forskjell i affinitet for Mono-S kasjon harpiks. Mono-S oppløsningen av bakteriell nuclease og PFV i tillater imidlertid ikke effektiv separasjon av proteiner. Til slutt, heparin sepharose affinitet rensing tilbyr beste separasjon av bakteriell nuclease fra PFV i og har fordelen av ubegrenset Last volum.
Testing av forurensende nuclease aktivitet kan tilpasses andre proteiner. Protein av interesse vil sannsynligvis ha alternative affinitet egenskaper enn PFV i; forskjellen i bindende egenskaper av protein av interesse og nuclease miljøgifter må bestemmes empirisk. Denne metoden for å identifisere nuclease forurensning kan tilpasses andre harpikser inkludert Mono-S kasjon eller Mono-Q anion exchange harpiks. Tilhørighet og ionebytte harpiks kan tilby en pålitelig metode for å isolere et rekombinant protein av interesse fra forurensende nucleases uten grenser for mengden protein under kromatografi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rekombinante proteinene som samhandler med DNA, DNA-reparasjon proteiner, oksygen renovasjonsarbeider for ett molekyl mikroskopi programmer eller retroviral integrases, som bør være fri for forurensende bakteriell nucleases2,3. Disse forurensningene kan forvirre tolkningen av resultater i bulk biokjemiske eller ett molekyl analyser.
Vi har funnet at en bakteriell nuclease ofte co renser med PFV modulen PFV i viser imidlertid en affin…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH AI099854 og AI126742 til nøkkelen.
Materials
| BL21/DE3 Rosetta E. coli | EMD Millipore | 70956-4 | |
| LB broth | EMD biosciences | 1.10285.0500 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| IPTG | Denville Scientific | CI8280 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF | Amresco | 0754 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250 | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Heparin Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0998-01 | |
| HRV14 3C protease | EMD Chemicals | 71493-3 |
Referências
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
- Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases. Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
- Li, M., Craigie, R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration. J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).
- Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R., Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).
- Sinha, S., Grandgenett, D. P. Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells. J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).
- Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase. J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).
- Vora, A. C., Grandgenett, D. P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
