コレステロール粒子の形態を調節することで脂質低下薬の効果
Summary
本研究の目的は、コレステロール粒子の形態を調節することで脂質を低下させる生体外で薬剤効果を評価することでした。脂質低下薬の比較では、コレステロール粒子の形態学的特徴を調節することでその効果の変化を明らかにしました。
Abstract
脂質低下薬高脂血症患者の治療は、低密度リポタンパク質 (LDL) レベルとプラズマの高密度リポタンパク質 (HDL) コレステロールの増加の中程度のレベルに低の大幅な削減につながります。ただし、コレステロール粒子の形態と分布を変えることでこれらの薬の役割はよくわかっていません。ここでは、cytometry 流れのイメージングとの組み合わせでプラークの配列法を用いたコレステロール粒子の形態学的特徴を調節することで脂質低下薬の効果の in vitro評価について述べる.ロスバスタチン、フルバスタチン、fibrates ナイアシンを誘導するのに対し、ロバスタチン、シンバスタチンとエゼチミブ、アトルバスタチンは、球状と線形鎖状粒子の形成を誘導すること示されたコレステロール粒子画像解析、唯一球形状粒子の形成。次、非常に精製された低密度リポタンパク質 (VLDL) とこれらの薬剤を添加して LDL 粒子は粒子集団のコレステロールの形態とイメージのテクスチャの変化を示した。さらに、50 の血清試料のスクリーニングは、高脂血症 (18.3% 平均) 年齢をマッチさせた正常 (平均 11.1% の) サンプルと比較して患者の線形形 HDL コレステロール粒子のより高いレベルの存在を明らかにしました。また血清中の LDL および HDL のコレステロール粒子形成形の線形を減らすことに脂質低下薬の効果にばらつきが観測されました。これらの調査結果を示す細胞による脂質代謝改善効果、脂質低下薬が非酵素作用機序によってコレステロール粒子の形態を変調直接。これらの結果の成果には、動脈硬化の診断に通知し最適な脂質低下療法を予測する可能性があります。
Introduction
多数の臨床試験は、高密度リポタンパク質 (HDL) コレステロールの増加の中程度のレベルに低密度リポタンパク質 (LDL) コレステロールおよび低の血漿中濃度を減らすことで脂質低下薬の有益な効果を示しているがアテローム性動脈硬化関連心血管イベント1,2,3,4、5のプライマリとセカンダリの両方の発生を防ぎます。Hmg-coa 還元酵素阻害剤のスタチン系薬剤は、内因性コレステロール血6,7で LDL コレステロールのレベルを循環下にリードを回すで肝臓で合成をブロックします。同様に、ナイアシンの効果を低くしている脂質はトリグリセリド合成8に関与する肝酵素アシル 2 ジアシルグリセ ロール肝細胞の直接的および非競合的阻害によって媒介されます。比較的、エゼチミブは9小腸の上皮細胞にあるニーマン ・ ピック C1-Like 1 (NPC1L1) 蛋白質による外因性コレステロールの吸収を制限することによって血漿 LDL のレベルを低減します。フェノフィブラート、別の脂質低下薬トリグリセリドの血中濃度を大幅に低減、また適度ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体経路10LDL コレステロールを減少させます。以外にも、オメガ 3 脂肪酸は、LDL11の血漿中濃度を下げることにより抗動脈硬化の効果があると報告されます。
LDL コレステロールを下げることで、主な効果に加え、脂質低下薬がある HDL レベルを向上、血管内皮機能を改善、炎症を減らす血小板を抑制など多面的効果の数集計12,13,14。ただし、HDL コレステロール粒子の増加とその構造的特徴を変更のこれらの薬剤の基になるメカニズムは完全には理解されていません。以来、これらの薬が心血管疾患のアテローム性動脈硬化関連 (スッテパー) の治療に広く処方されて、さらに形態学的特徴および脂質粒子の分布の決定の役割を調べることが不可欠です。約 600 の脂質および分子 22 種類、様々 なサイズ、形状、密度、および組成15,16,17 に存在するコレステロールの成っているひと血漿 lipidome.超遠心分離、NMR、勾配ゲル電気泳動法などの分析手法は、LDL と HDL の粒子との亜分画18,19を特徴付けるに使用されます。ただし、これらのメソッドのアプリケーションは形態および脂質粒子のアセンブリを調節することで薬の効果を決定するを目的とした研究に限定されます。流れの cytometer ベース プラーク配列は機能生化学アッセイ開発の検出、血清の可視化派生脂質およびアミロイドのプラク粒子20。体外イメージング研究ではこの説明法の利点は、バッファーと血清試料中のコレステロール粒子の形態と分布を変えることで薬剤の効果を脂質変調の識別を有効にします。
Protocol
1 準備の蛍光ラベル コレステロールと脂質低下薬 注: 私たちの以前の記事で説明したように蛍光コレステロール集計とスタチン系薬剤が準備された。 21 します詳細については本研究で使用されるデータ解析ソフトウェア、化学分析装置、フローサイト イメージング試薬の 材料表 を参照してください。。 凍結乾燥コレステロールの蛍光標識を可溶化 (1 mg Ex/Em = 495 nm/507 nm) を 1 mL 100% アルコールの粉末。 2,040 × g で 3 分のサンプルを遠心し、プラークアッセイ配列の水溶性蛍光標識コレステロール骨材を含む上清を使用します。 薬の準備のため個別に可溶化粉末 (2 mg) を 1 ml 100% アルコールのオメガ 3 脂肪酸、エゼチミブ、アトルバスタチン ロバスタチン シンバスタチン。 2,040 × g で 3 分間遠心分離した後薬剤アッセイを含む上清を使用します。 同様に、可溶化個別に粉末 (2 mg) フルバスタチン、ロスバスタチン、ナイアシン、2 mg/mL の原液を作るために脱イオン水 1 mL に fibrate と。 2,040 × g で 3 分間遠心分離後プラークアッセイ配列で薬を含む上清を使用します。 2。審査 体外 コレステロール粒子形成配列プラークアッセイ 使用化学アナライザー-1 (材料の表を参照) コレステロール粒子形成のプラークアッセイ配列を設定します。丸底、セクション 1 で調製試薬を用いる低蛋白結合 96 ウェル プレートでアッセイを実行します。各 200 μ L でも最終反応体積を維持し、3 通すべてのアッセイを行う。 まず、リン酸の負荷 194.5 μ L 緩衝生理食塩水 (PBS) 各ウェルにします。 各も各脂質低下薬ソリューションの 2.5 μ L (5 μ g) を追加し、30 の板を振る ソリューションに薬剤を均一に混合する化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことで s。薬は陰性対照サンプルに追加されません。 最後に、各ウェルに 2 μ L (2 μ g) 蛍光コレステロール集計ソリューションを追加し、30 の板を振る化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことによって s. 37 ° C、200 rpm で設定 2 h のラボ シェーカーでプレートをインキュベートします。 インキュベーション後、フローサイトメトリーによる粒子の画像を取得します。 3。キャプチャ画像のコレステロール粒子を用いたイメージング フローサイトメトリー オープン データ収集テンプレート正しい計測器設定を読み込めません。クリックして " ファイル " を選択、" テンプレートを開く … " テンプレート ファイルを選択。 をクリックして " フラッシュ、ロック、負荷 " サンプル読み込み用計測器を準備する。 時、" を読み込むサンプル " 対話ボックスが開き、をクリックして " OK " イメージングの流れの cytometer にセクション 2 でも作成から 50 μ L のサンプルをロードする。 をクリックして " を実行 |セットアップ " リアルタイムでイメージング領域にパーティクルを表示する。 イメージングの領域に粒子が良いフォーカスをクリックして " を実行 |取得 " 黄色蛍光、蛍光グリーン、明るいフィールド (BF) 暗視野 (側散布/SSC) の高スループット方法で各オブジェクトの画像を同時に取得する。 3.2 3.5 各サンプルから 5,000-10,000 の粒子を取得する手順を繰り返します。 画像解析ソフトを使用してオブジェクトの蛍光強度と形態学的変化を決定するすべての raw 画像ファイルを分析します。 をクリックして、" ツール " 画像解析ソフトの上部にあるボタンをクリックし、[" バッチ データ ファイル " が開かれるドロップ ダウン メニューから、" バッチ " ウィンドウ。 で、" バッチ " ウィンドウ、クリックして、" 追加バッチ " ボタンを開いて、" バッチを定義 " ウィンドウ。 で、" バッチを定義 " ウィンドウ、クリックして、" ファイルの追加 " ボタンし raw イメージ ファイルを選択し、[、" テンプレート " 適切なデータ分析テンプレート ファイルを選択し、選択ボタンをクリックして " [ok] " と " 送信バッチ "raw 画像ファイルの処理、分析を開始します。 4。プラーク配列分析による評価の脂質低下薬コレステロール粒子の精製及ぼす ステップ 2.1 で説明したよう実行精製 VLDL、LDL、HDL リポタンパク質/粒子を用いたコレステロール粒子形成アッセイ。96 ウェル プレートでプラークの配列分析を実行します。 、PBS のすべての井戸を読み込む; 各ウェルに 200 μ L の最終巻を使用します。 ネガティブ コントロール追加 4 μ g VLDL、LDL、または HDL 蛋白質/粒子個別に薬なしもし、30 の板を振る s. の脂質低下薬の効果を調べると、4 μ g VLDL、LDL を追加または HDL 蛋白質/粒子それぞれ個別にも、30 の板を振る s. 井戸 4 μ g VLDL や LDL、HDL で追加した、2.5 μ L (5 μ) エゼチミブ、ロバスタチン、シンバスタチン、またはナイアシン ソリューションを追加し、30 の板を振る化学アナライザー-1 に置くことで s. 最後に、すべてのウェルに 2 μ L (2 μ g) 蛍光標識コレステロール集計ソリューションを追加し、30 の板を振る化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことによって s. 37 ° C、200 rpm で設定ラボ シェーカーで 2 h のプレートをインキュベートします。 次のステップ 3.1 から 3.5 イメージング フローサイトメトリーを使用してサンプルを取得します。 3.7 の手順で説明されているように画像解析ソフトを使用して raw イメージ ファイルを分析します。 解析テンプレートでコレステロール粒子集団の同定のため以下のゲーティング スキームを使用します。 飽和緑チャンネル ピクセル数 (x 軸) と暗視野のチャネルのプロット上飽和画素数 (y 軸)、いずれかのチャネルで 1 つ以上の飽和ピクセル オブジェクトは拒否します。 飽和ピクセル グリーン チャンネルの強度 (x 軸) と SSC 強度 (y 軸) を使用してせずにオブジェクト/粒子を印刷: オブジェクト、緑のチャネルと SSC 強度に基づいて 3 つの地域 (VLDL、LDL、HDL) のいずれかに分類できます 。 注: これらのゲートは、蛋白質を使用して精製された VLDL、LDL、HDL 粒子/薬がなければ実施制御実験から生成されたデータに基づいて作成されました。 各サンプルの脂質低下薬の効果を判断するに記載されている手順 6.5 として総リポ蛋白粒子濃度だけでなく、各サブポピュレーション (VLDL、LDL、HDL) の比率を計算します。 計算粒子濃度 (粒子/mL) 次の同等化を使用して: 注:、VLDL、LDL、および HDL ゲート蛍光ドット プロット領域検出 〜彼らのそれぞれ球と残りの 80% 〜 粒子の 20% が他ゲート領域とオーバー ラップします。 5。血清脂質濃度の測定 化学アナライザー – 2 LDL、HDL、コレステロールおよびトリグリセリドの濃度を決定する、年齢をマッチさせたノーマルと高脂血症被験者から得られた血清を使用します。 LDL、HDL、コレステロールおよびトリグリセリドの濃度と血清で上限と下限の基準値を超えて識別の異常な濃度を定義します。 に従って通常の参照値あded 試薬製造元によって: コレステロール (4 200 mg/dL)、HDL (3.0 65 mg/dL)、(4-100 mg/dL)、LDL およびトリグリセリド (9-200 mg/dL). 血清脂質低下薬の有無のスクリーニングのためにそれらを使用コレステロールとトリグリセリドの値より低い基準値以下またはより高い参照の上と異常値を持つ識別します。 6。血清中コレステロール粒子形成に対する薬物の効果を分析 使用化学アナライザー-1 血清中コレステロール粒子形成のプラークアッセイ配列を設定します。丸底、低蛋白結合 96 ウェル プレートでアッセイを実行します。200 μ L/ウェルの最終反応量を使用し、3 通すべてのアッセイを実行します。 試薬を段階的に読み込むことによって板を準備する。 コントロール井戸を準備します。 ロード 193 μ L の PBS を各ウェル。 2.5% (v/v) 患者血清 (ウェルあたり 1 つだけ血清サンプル) を追加し、30 の板を振る化学アナライザー リアクション プレート上に置くことによって s. 蛍光標識コレステロールの追加 2 μ L (2 μ g) を各ウェルにソリューションを集約し、30 の板を振る化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことによって s. 薬井戸の準備します。 ロード 191 μ L の PBS を各ウェル。 2.5% (v/v) 患者血清 (ウェルあたり 1 つだけ血清サンプル) を追加し、30 の板を振る化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことによって s. 追加 2 μ L エゼチミブ、ロバスタチン、シンバスタチンまたはナイアシン ソリューション (4 μ g) すべてのウェルには、陰性対照の井戸を除きます。ウェルあたり 1 つだけ薬を追加し、30 の板を振る化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことによって s. 蛍光標識コレステロールの追加 2 μ L を各ウェルにソリューション (2 μ g) を集約し、30 の板を振る化学アナライザー 1 リアクション プレート上に置くことによって s. すべての井戸の後にのみ薬剤を読み込む (制御および薬物治療)、それぞれ血清サンプルを装填しているし、このステップの終わりに蛍光標識のコレステロールを追加。 37 ° C、200 rpm で設定ラボ シェーカーで 2 h のプレートをインキュベートします。 流れの cytometer 次の手順 3.1 3.6 で説明する設定をイメージングによるサンプルを取得します。 バッチ 3.7 の手順で説明されているように同じテンプレートを使用してすべてのイメージ ファイルを処理のためのソフトウェアの分析画像を使用します。 4.5 および 4.6 の手順の説明に従って、プロット上ゲートを描画することによってデータの分析を実行します。 応答を判断する脂質低下薬効果/(低、中、高) の各サンプルに対して、総リポ蛋白粒子濃度だけでなく、HDL、LDL、VLDL を構成する全粒子の割合を計算します。subpopulations。 プロット オブジェクトのヒストグラムを HDL、LDL、VLDL の集団 ' s 明視野像、球状または線形領域の長さ (長さ・幅) とゲートから減算の幅: (長さ・幅) を持つオブジェクト ≤ に陥る 2 μ m、球状のおよび線形の割合を計算するための球状領域形粒子。 は、球状と線形形 LDL および HDL コレステロール粒子孵化各薬剤の有無にかかわらず各血清サンプルの特定の割合を比較します。各血清サンプルで得られた値を帳票、間で球状と線形の割合形薬の効果の定量 SD ± 2 の範囲内にある LDL および HDL の粒子を受け入れる。
Representative Results
プラークアッセイ アレイを用いたコレステロール粒子形成に脂質低下薬の効果の解析。 コレステロール粒子の形態におけるスタチン系薬剤の効果を評価するため蛍光コレステロール集計ロバスタチンとシンバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、バッファーにフルバスタチンを個別に培養。すべてのこれらのサンプルは、図 1および図 2に示すように、形態分析のためコレステロール粒子の画像をキャプチャするイメージングのフローサイトメトリーを用いた買収されました。興味深いことに、ロバスタチンとシンバスタチン、アトルバスタチンは、多様なサイズと形状、コレステロール粒子の異種集団の形成を誘導することを示されるバッファーのコレステロール粒子形成に薬の効果を分析図 3a-cします。逆に、ロスバスタチン、フルバスタチンの存在下で形成されるコレステロール粒子と (薬) なしマイナス コントロールが均一な形状や形態図 3 d-fのよう。また、ロバスタチンとシンバスタチン、アトルバスタチンは両方の球状と線形鎖の形態を示すコレステロール粒子の形成を誘起しているロスバスタチン、フルバスタチンによるコレステロールの形成に対しであることが分かった粒子球状形態のみ。ロバスタチンの 16%、2%、シンバスタチン、アトルバスタチンの 0.2% の順序で線形鎖形成を誘導するのにスタチンの効果が見つかりました。 さらに粒子形成に脂質低下薬の効果の評価、蛍光コレステロール集計個別を添加してエゼチミブ、fibrate、ナイアシン、およびオメガ 3 脂肪酸。スタチンと観察、これらの薬には異種サイズと形状図 4 a-dに表示されるコレステロール粒子の形成が誘導されます。その中でも、エゼチミブによる形成に対し両方の球状と線形鎖の形態を示すコレステロール粒子の fibrate、ナイアシン、およびオメガ 3 脂肪酸誘導唯一球形状コレステロール粒子の形成。したがって、コレステロール粒子形成形線形鎖に及ぼす薬物のエゼチミブ, 0% 3% の順であった fibrate、ナイアシン、0%、0% オメガ 3 脂肪酸。 形態素解析では、各形球状または線形鎖コレステロール粒子は一緒にリンクされている多くのより小さい粒子から成るを明らかにしました。線形形粒子のサイズは、2 〜 60 μ m2の範囲に対し、識別蛍光陽性球状コレステロール粒子のサイズが 2 〜 30 μ m2の範囲内。 脂質低下薬の精製された VLDL と LDL 粒子に及ぼす影響の分析。 存在下で、リポタンパク質コレステロール粒子の形成をさらに確認するには、蛍光コレステロール集計精製の VLDL、LDL、HDL 粒子タンパク質を個別に培養。結果は、VLDL タンパク質コレステロール粒子、図 5のより高い数の形成の原因で培養されたコレステロール集計である LDL および HDL の粒子をインキュベーションと比較して示した。さらに、コレステロール粒子の 2 つの主要な分数は蛍光コレステロール骨材を孵卵中 LDL 分画にその部分的な変換を示唆して VLDL 集団で観察されました。粒子画像解析には、球状 (~ 97%)、HDL、LDL、VLDL の集団間の線形の形 (〜 3%) 粒子の存在が示されています。線形粒子のサイズの範囲は 2 〜 60 μ m2に対し、球状粒子のサイズの範囲は 2 〜 30 μ m2、です。 精製した粒子の脂質低下薬の効果を調べるため VLDL と LDL 粒子エゼチミブ、ロバスタチンとシンバスタチン、ナイアシンを個別に培養。その結果、薬がなければ制御実験と比較して、VLDL 粒子形成で観察された薬の効果で高かったエゼチミブ、シンバスタチン、ロバスタチン、ナイアシン。薬と孵化させる LDL 粒子は主要な 1 つの画分を示し、エゼチミブ、シンバスタチン、ロバスタチン、ナイアシン、図 6で粒子形成における薬物誘起効果が高かった。 血清中コレステロール粒子の分布を変えることで脂質低下薬の効果のバリエーション: 薬の効果を評価するため精製リポタンパク質と緩衝液の前の実験を行った。したがって、次のステップ、コレステロール粒子形成に脂質低下薬の効果は、脂質異常症 25 患者と 25 年齢をマッチさせた健常者から収集した 50 の血清試料を検討しました。各血清サンプルの薬剤反応は、薬の有無でコレステロール粒子形成のプロファイルの変化に基づいて測定しました。プラークアッセイ配列の各血清サンプル エゼチミブ、ロバスタチンとシンバスタチン、ナイアシンの医薬品に対するスクリーニングを行った。結果には、削減 LDL と HDL コレステロール粒子形成の増加に影響特に血清試料中の VLDL、LDL、HDL の粒子の分布を調節する際にこれらの薬の中で格差が明らかにしました。高脂血症血清脂質低下薬にユニークな応答を出展の 3 つの代表は、図 7のとおりです。 血清の変調の形態に薬物の影響の識別は、LDL と HDL コレステロール粒子派生。 血清由来コレステロール粒子の表現型解析に線形鎖の球状形 VLDL、LDL、存在が明らかになったし、HDL は subpopulations、こうして識別実験では同様の形態を確認する実行バッファーの両方と精製されたリポ蛋白粒子図 8に示すように。しかし、球状と線形形コレステロール粒子集団の分布は広く高脂血症と年齢をマッチさせた健常者の間で変化。特に、薬なしで実行制御法は線形鎖の分布に違い形 LDL コレステロール粒子の高脂血症 (2.0% の平均) と年齢をマッチさせた標準 (1.3% の平均) 血清サンプルを示した。同様に、HDL コレステロール粒子の形線形鎖の増加レベルは年齢をマッチさせたに比べて脂質サンプル (18.3% の平均) で観察された血清 (平均 11.1%)。相関関係では、法は、シンバスタチン (8.3% の平均)、エゼチミブ (11.5% の平均)、ロバスタチン (11.7% の平均) の形をした HDL コレステロール粒子形成は線形の有意な減少を示した高脂血症の血清中薬物の面前で演奏ないの低減とナイアシン (18.3% の平均)。さらに、高脂血症血清サンプル表 1に表示される薬で培養したときの線形形 LDL コレステロール粒子の形成の減少が観測されました。 さらに、法は、年齢をマッチさせた対照血清サンプに薬の存在下で実行レは、シンバスタチン (5.0% の平均)、エゼチミブ (平均 8.2%)、ロバスタチン (平均 8.7%)、ナイアシン (平均 10.8%) に示す表 2として HDL コレステロール粒子の形線形の有意な減少を示した。高脂血症と年齢をマッチさせた正常な血清サンプル線形形 LDL と HDL コレステロールの粒子に球状の形をしたコレステロール粒子 (データは示されていない) の相対的な増加を示した薬剤誘発性低減を出展します。 図 1: 図コレステロール粒子形態の生体外での可視化のプロセスを説明します。(a、b)バッファーまたは血清試料中の脂質低下薬の追加。(c) 蛍光標識溶けるコレステロール添加サンプルを集約します。(d) イメージング フローサイトメトリーを用いた不溶性コレステロール粒子の形態素解析結果のサンプルを取得します。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2: イメージング フローサイトメトリーを用いたコレステロール粒子の 2 つの異なる形態の Id 。(、) の粒子は、明視野画像のテクスチャ解析に基づく線形または球状の集団に分離されます。具体的には、H の意味同質性 (x 軸) と意味 H エントロピー (y 軸) のドット プロットは球状 (赤) を検出するための 2 つのゲート領域を含み線形鎖形 (青) コレステロール粒子。(b) 画像は人口 1 で識別された球状の形をした粒子の形態を表示します。(c) 画像線形鎖の形粒子 2 の人口で識別されます。(d) 集団とその濃度を決定するために使用すべての蛍光正コレステロール粒子の分布を示すヒストグラム。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3: 画像ギャラリー コレステロール粒子形成におけるスタチン系薬剤の効果を表示します。明るいフィールドは、従来の流れの cytometer で FSC のようの領域を指します。緑のチャネルは、505 560 nm で検出された蛍光性の放出と黄色いチャネルが 560 595 nm で検出された蛍光性の放出を指します。(a ~ e)イメージのギャラリーがそれぞれロバスタチンとシンバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチンの存在下で形成されたコレステロール粒子の形態を表示します。(f) スタチン (マイナス コントロール) の不在でコレステロール粒子形成。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4: コレステロール粒子形成を調節することで脂質低下薬の差動効果を発揮します。(a ~ d)コレステロール粒子の形態を表示する画像ギャラリーは、オメガ 3 脂肪酸、ナイアシン、fibrate、エゼチミブの存在下でそれぞれ形成されました。緑のチャネルは、505 560 nm で検出された蛍光性の放出と黄色いチャネルが 560 595 nm で検出された蛍光性の放出を指します。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 5: HDL、LDL、VLDL コレステロール粒子の形成の不在で医薬品分析します。ドット プロット: x 軸表示 (505 560 nm) の蛍光グリーン チャンネルで検出されたコレステロール粒子のスペクトルと y 軸側の散布図が表示されます。ゲート蛍光ドット プロットで検出された VLDL、LDL、HDL の粒子の領域を示しています。(、) 精製された VLDL コレステロール粒子形成。(b) 代表 VLDL 粒子の画像。(c) 精製された LDL コレステロール粒子形成。LDL の粒子の (d) 代表の画像。(e) 精製された HDL コレステロール粒子形成。HDL 粒子の画像を (f) 代表。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 6: VLDL と LDL コレステロールの粒子を精製の脂質低下薬の効果を発揮します。薬がなければ (、) VLDL の粒子。(b) VLDL 粒子エゼチミブで孵化します。(c) VLDL の粒子は、ロバスタチンと孵化させます。(d) VLDL 粒子はシンバスタチンと孵化させます。(e) VLDL の粒子は、ナイアシンと孵化させます。(f) LDL 粒子は、薬がなければ孵化。(g) LDL 粒子はエゼチミブで培養されました。(h) LDL 粒子は、ロバスタチンと孵化させます。(私) LDL 粒子はシンバスタチンと孵化させます。(j) LDL 粒子は、ナイアシンと孵化させます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 7: 血清中の HDL、LDL、VLDL コレステロール粒子形成を調節する際に薬を低くしている脂質の差動効果を示す蛍光ドット プロットします。一番上の行、0 ~ 15 %hdl 粒子形成を増加血清 1 表示低レベルの薬物反応のスクリーニング真ん中の行、50 %hdl 粒子に 16 を増加血清 2 示す中程度レベルの薬物応答のスクリーニング一番下の行は、血清 3 示す高いレベルの薬物応答増加する HDL の粒子を 100 のスクリーニング。(、f、k)血清薬なし。(b, g, l)血清サンプルはエゼチミブで培養されました。(c, h, m)血清は、ロバスタチンと孵化させます。(d は、私は、n)血清サンプルはシンバスタチンと孵化させます。(e, j, o)血清は、ナイアシンと孵化させます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 8: 血清中識別されるコレステロール粒子の形態を表示する画像ギャラリー サンプル 1.緑のチャネルは、粒子からの蛍光性の放出の画像を示しています側方散乱 (シアン チャネル) 画像を示す励起レーザーの光の粒子によって散乱します。薬がなければ (、) 球状と線形形コレステロール粒子が形成されます。(b、c、d、e)コレステロール粒子はそれぞれエゼチミブ、ロバスタチンとシンバスタチン、ナイアシンの存在下で形成されました。縮尺記号= 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 血清 ID 薬 (コントロール) なし エゼチミブで ロバスタチンと シンバスタチンと ナイアシン 線形、LDL 粒子の % 線形、HDL 粒子の % 線形、LDL 粒子の % 線形、HDL 粒子の % 線形、LDL 粒子の % 線形、HDL 粒子の % 線形、LDL 粒子の % 線形、HDL 粒子の % 線形、LDL 粒子の % 線形、HDL 粒子の % PND-01 1.73 45.2 0.81 18.1 0.61 16.1 0.59 13.9 2.26 33.6 PND 02 2.86 35.9 1.26 30.9 1.27 22.7 0.73 15.2 3.03 37.7 PND 03 2.04 35.8 0.87 4.82 1.02 4.14 0.36 3.06 0.45 9.57 PND 04 2.56 32.9 1.15 21.8 1.12 18.6 0.77 17.2 3.37 36.5 PND 05 0.42 29.2 0.24 5.62 0.22 8.72 0.16 9.91 0.35 22.2 PND 06 1.8 28.1 0.4 16.8 0.62 15 0.42 9.27 2.28 38.4 PND 07 1.8 26.5 0.85 10.5 1.18 19.9 0.62 7.32 1.29 23.4 PND 08 0.98 22.8 0.86 7.28 1.55 10.2 0.14 5.98 0.59 13.3 PND 09 3.87 22.1 1.98 9.56 1.87 10.3 1.46 7.96 2.86 9.88 PND 10 4.46 21.9 2.57 13.6 4.04 17.1 2.28 11.9 0.71 25.7 PND 11 1.57 19.2 1.15 9.24 1.37 6.98 0.74 5.03 1.37 16 PND 12 1.06 16.7 0.66 4.38 0.7 4.74 0.99 6.36 1.14 4.73 PND 13 4.85 16.6 1.28 30.4 1.4 32.6 0.8 16.6 4.02 31 PND 14 2.08 16 0.68 15.4 0.64 16.5 1.97 10.2 1.25 20.11 PND 15 1.5 11.9 1.14 13.3 1.21 11.4 0.8 6.12 1.38 4.59 PND 16 1.82 10.4 2.04 9.59 1.24 5.62 0.91 5.38 1.31 7.61 PND 17 1.05 10.3 1.02 4.7 1.78 15.1 0.93 7.81 1.27 13 PND 18 1.11 8.76 0.54 3.68 0.61 3.51 1.01 5.03 1.02 6.69 PND 19 1 8.52 0.75 6.67 0.76 5.86 0.91 8.36 1.22 11.9 PND 20 3.54 7.92 3.78 12 3.56 5.81 3.28 8.28 3.44 12.3 PND 21 1.88 7.69 2.12 11.4 1.73 9.54 1.77 8.34 2.32 16.7 PND 22 1.64 7.17 0.35 5.75 0.56 13.2 0.14 4.33 1.23 17.8 PND 23 1.54 6.27 1.25 7.24 1.02 6.12 0.73 3.58 1.42 6.69 PND 24 0.53 6.22 0.52 4.49 0.91 5.57 0.54 4.01 0.65 10.5 PND 25 2.97 5.1 1.59 11 1.88 9 1.03 6.54 2.61 29.1 表 1: 高脂血症のスクリーニング プラークアッセイ配列の血清サンプルで示します脂質低下薬の差動効果。薬 (列 2、3) なしのコントロールに比べて、エゼチミブ (列 4、5)、ロバスタチン (列 6、7) を培養している血清サンプルは (列 8、9)、シンバスタチンとナイアシン (列 10、11) を示した線形状の LDL および HDL のコレステロールを誘導する変奏曲粒子の形成。 血清 ID 薬なし エゼチミブで ロバスタチンと シンバスタチンと ナイアシン 線形、LDL 粒子の % 線形、HDL 粒子の % 線形、LDL 粒子の % 線形、HDL 粒子の % 線形、LDL 粒子の % 線形、HDL 粒子の % 線形、LDL 粒子の % 線形、HDL 粒子の % 線形、LDL 粒子の % 線形、HDL 粒子の % プナン-01 2.05 26.8 0.62 11.9 0.56 16.9 0.52 9.28 1.4 11.9 プナン 02 1.35 26.3 1.68 21.8 2.59 23.6 0.79 6.92 2.16 29.7 プナン 03 2.4 24.9 0.53 7.54 0.57 13.8 0.55 5.82 1.7 4.71 プナン 04 1.99 21.5 1.54 9.45 1.56 8.25 0.31 3.74 2.88 20.8 プナン 05 1.77 18.8 1.49 6.03 1.65 5.5 0.54 4.67 1.2 8.19 プナン 06 1.12 15.2 0.67 4.42 2.68 13.3 0.5 2.37 1.54 16.3 プナン 07 1.03 14.4 0.79 6.83 1.45 7.91 0.67 5.36 1.57 12 プナン 08 0.98 14.3 0.88 4.48 2 7.1 0.19 2.66 1.02 18.1 プナン 09 2.85 14.1 1.95 12.6 2.34 12.5 0.7 6.24 1.84 18.7 PNAN10 1.01 10.4 0.8 5.07 0.51 5.9 0.87 6.5 1.63 10.9 プナン 11 0.92 12.4 0.21 9.94 0.29 3.31 0.29 6.52 0.58 10.4 プナン 12 0.6 10.5 0.56 5.78 1.06 4.74 0.4 3.32 0.91 11.8 プナン 13 1.25 10.3 0.45 3.79 0.67 6.53 0.27 3.17 0.8 6.28 プナン 14 1.03 9.86 1.12 8.51 1.05 6.91 0.6 5.94 1.05 8.14 プナン 15 2.28 8.1 1.93 10.4 2.14 886万 1.56 6.84 2.31 8.61 プナン 16 1.98 7.69 0.45 4.36 1 5.46 0.27 2.89 0.49 4.12 プナン 17 1.72 6.72 0.75 14.8 0.74 9.26 0.49 5.58 1.98 12.8 プナン 18 2.45 6.38 0.85 16.8 0.89 14.2 0.58 5.9 1.8 20.6 プナン 19 1.67 5.12 0.58 8.63 0.65 5.7 0.64 8.8 1.88 2.08 プナン 20 1.17 4.41 0.85 7.77 0.91 6.43 0.69 5.08 1.21 6.12 プナン 21 0.31 4.18 0.48 6.95 0.19 5.09 0.15 2.1 0.29 5.93 プナン 22 0.77 4.02 1.24 7.41 0.61 5.02 0.29 3.49 0.42 3.98 プナン 23 0.4 1.25 0.75 6.25 0.88 5.91 0.9 5.06 0.82 6.71 プナン 24 0.45 1.1 0.63 2.5 0.55 5.32 0.9 4.3 0.71 3.5 プナン 25 0.36 1 0.73 2.4 0.66 5.1 0.82 4 0.7 3.4 表 2: 配列プラークアッセイで年齢をマッチさせた対照血清試料のスクリーニングは脂質低下薬の差動効果を示す。薬 (列 2、3) なしのコントロールに比べて、エゼチミブ (列 4、5)、ロバスタチン (列 6、7) を培養している血清サンプルは (列 8、9)、シンバスタチンとナイアシン (列 10、11) を示した線形状の LDL および HDL のコレステロールを誘導する変奏曲粒子の形成。
Discussion
一般に、分布と血液の循環、HDL、LDL、VLDL のコレステロール粒子の機能特性主に代謝、遺伝的、疫学的、携帯と血漿因子22,23によって決定されます。本研究では脂質の変更の影響を調べるバッファー内薬エゼチミブ、ロバスタチンとシンバスタチン、アトルバスタチンなど高脂溶性薬物がコレステロール粒子の形態により高いレベルの複雑さを誘発を明らかにしました。超親水性のロスバスタチン、フルバスタチンの薬で観測された低レベルの効果と比較。これらの結果は、良い契約、バッファーおよび血清サンプル21で LDL と HDL のコレステロール粒子形成を調節する際にスタチン系薬剤の非酵素的方式の効果を説明する私たちの以前の研究でしたがって、本研究の結果は、非酵素的エゼチミブ、fibrate、ナイアシン、コレステロール粒子形成を調節することに直接的な役割を果たす可能性がありますオメガ 3 脂肪酸薬の作用機構を明らかにしました。薬とコレステロール骨材間の相互作用が球状と線形鎖の形態を示す 2-60 μ m2、大型コレステロール粒子のアセンブリをもたらすことが可能です。
精製されたリポ蛋白粒子を使用して得られた結果がコレステロール集計および組成とコレステロールの形態学的性質を変更することが HDL、LDL、VLDL の蛋白質を含むプラズマの要因間の相互作用を提案するほか、粒子。精製リポ蛋白粒子を含む薬物治療の結果には、VLDL 粒子形成に比べて LDL コレステロール粒子形成で観察された効果の高いレベルの薬の効果が示されます。ロバスタチンとシンバスタチン、エゼチミブの薬はプロ薬として使用され、その投与法が生理学的濃度を上回る可能性があります。
興味深いことに、HDL、LDL、VLDL コレステロール粒子形成のプロファイルを変更することで薬の効果の変化を示した血清試料のスクリーニング、線形の形成に及ぼす影響特に LDL および HDL の粒子の形。これらの薬剤は、高脂血症と年齢をマッチさせた正常血清 LDL および HDL のコレステロール粒子形成形線形減少を誘発しました。シンバスタチン、エゼチミブ、ロバスタチン、およびナイアシンの線形形粒子の形成を減らすことで薬の効果が高かった。球状と線形鎖形態通常と高脂血症の血清コレステロール粒子の同定を示唆と同様の形態を有する粒子が生体内での条件のフォームがあります。以前の研究は、ディスクと針のようなコレステロール結晶を来す-/-マウス モデル24,25,26 とアポ-/- 、人間の動脈硬化性プラークの存在を識別しました。、27,28。
血で循環する HDL 粒子存在異種混合物および機能活動と共に小規模および大規模サイズ HDL 粒子のレベルが逆のコレステロールの輸送を介して自分の心臓保護効果を発揮する重要な要因として経路29,30。最近の研究は識別する HDL コレステロール粒子亜分画31 コレステロール排出、抗炎症、抗血栓、抗酸化などの複数の生物学的機能における役割を解明するための重要性を強調しています。.さらに、多くの研究は、昇順にプラズマ1,5,21の HDL のレベルを中程度に低脂質低下療法の効果を報告しています。したがって、本研究の結果は、コレステロール粒子の形態学的特徴に新たな洞察を提供します。特に、高脂血症被験者の血清試料中の線形形 HDL コレステロール粒子のより高いレベルの検出は診断と脂質修飾の影響評価のための信頼性の高いバイオ マーカーこと示唆している患者における薬。しかし、さらに調査が必要なコレステロール粒子の形態と CVD への関連付けを理解する大きな臨床サンプルを用いたします。
プラークアッセイ配列コレステロール粒子のアセンブリに薬の効果を調べるため、我々 使用蛍光ためコレステロール集計と 5 µgof の医薬品をラベルのの 2 μ g: (1) 薬は競争力のある両方の蛍光コレステロールをラベルにバインドと内因性脂質血清サンプル中に存在(大きいサイズと 2 〜 60 μ2に至る形状にまとめられる 5,000、10,000 コレステロール粒子を取得しました 2)、各サンプルから(麻薬 (5 μ g に投与量 300 ng) と高用量コレステロール粒子形成のプロファイルに検出可能な変化は見られなかったと孵化させるそれらの 1 ~ 5%, 血清サンプル中の薬剤応答のワイド バリエーションを観察 3)(4) コレステロール集計と脂質低下薬の相互作用は、非酵素的反応により媒介されます。それ故に、アッセイに使用する試薬の濃度は生理的レベルよりも高い可能性があります。
結論としては、体外イメージング法のコレステロールの形態と組成を調節することで幅広い脂質低下薬の効果を決定するため、この研究で説明した利点を正常に示しました。粒子。可視化と画像解析アルゴリズムの星座を用いた脂質粒子の形態の定量化の方法は、アテローム性動脈硬化と脂質低下療法の成果を評価する両方の診断を助けるかもしれない。
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、Plaxgen 研究で賄われていた SM (plx 社-1008) に与えられる補助金。IRB の承認の下で動脈硬化科目から血清試料を採取、パロ ・ アルト医療研究財団研究所に感謝します
Materials
| TopFluor fluorescent cholesterol | Avanti Polar lipids | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| simvastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| lovastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| rosuvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| atorvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| fluvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| ezetimibe (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| Niacin | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| fibrate | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| omega-3 fatty acid | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| purified VLDL proteins/particles | Lee Bio | ||
| purified LDL proteins/particles | Lee Bio | ||
| purified HDL proteins/particles | Lee Bio | ||
| Human age-matched serum | Dx Biosamples | ||
| Human atherosclerosis serum | Bioserve | ||
| Human normal serum | Stanford Blood center | ||
| LDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
| HDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
| Total cholesterol measurment | Roche Diangostics | ||
| 96-well microtitre plates | |||
| Triglycerides measrument | Roche Diangostics | ||
| Amnis Imaging Flow cytometer | Amnis Inc | ||
| IDEAS image analysing software | Amnis Inc | ||
| Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 | Awarness Technology | ||
| Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 | Roche Diangostics |
Referências
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Citar este artigo
Madasamy, S., Liu, D., Lundry, J., Alderete, B., Kong, R., Robinson, J. P., Wu, A. H., Amento, E. P. Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles. J. Vis. Exp. (129), e56596, doi:10.3791/56596 (2017).