Asignación simultánea y la cuantificación de ribonucleótidos en el ADN mitocondrial humano

este protocolo se describe en la figura 1 e incluye el aislamiento del gDNA, digestión con enzimas de restricción para poder cuantificar el número de ribonucleótidos, tratamiento con álcali para hidrolizar los enlaces fosfodiéster de ribonucleótidos incorporados del gDNA, fosforilación de extremos libres 5´-OH, ligadura de ssDNA de adaptadores, segunda síntesis de strand y amplificación por PCR antes de la secuencia. 1. adaptadores y cartillas del índice ARC49 obtener ARC140 oligonucleótidos, ARC76/77, adaptador y ARC78-ARC107 cartillas de índice (ver tabla 1). Nota: Oligonucleótidos deben ser purificada de HPLC. ARC76/77 se ordenan como dúplex. Preparar 100 μm las soluciones madre de cada oligonucleótido en tampón Tris-EDTA (TE) (véase la Tabla de materiales) y almacenar a -20 ° C. Preparar 10 soluciones de μm de ARC67/77 y 2 μm de primers ARC49 e índice diluyendo en tampón de elución (EB; vea la Tabla de materiales). Almacenar a-20 ° C. 2. Crecimiento y cosecha de las células las células HeLa crecen en 70 mL Dulbecco ' s medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con suero bovino fetal 10% en un matraz de 250 mL cono a 37 ° C. Cuenta el número de las células y recoger 5 x 10 6 células en un tubo de 50 mL, centrifugar durante 5 min a 200 x g y descarte el sobrenadante. Lavar las células con 20 mL 1 x PBS, centrifugar durante 5 min a 200 x g y descarte el sobrenadante. Congelar las pelotillas a-20 ° C o continuar con la purificación de DNA a. 3. Purificación de DNA y cuantificación purificar gDNA usando extracción de fenol-cloroformo como se describe abajo. Resuspender las células en 2 mL de tampón de lisis (ver la Tabla de materiales) e incubar durante 30 min a 42 ° C en un bloque calefactor. PRECAUCIÓN: El tampón de lisis contiene componentes peligrosos. Solución de SDS es irritante, proteinasa K sensibilizantes, irritantes y tóxicas. Use ropa protectora y guantes de. Dividir la muestra en dos tubos de 2 mL y añadir 1 volumen (V) de fenol-cloroformo-isoamyl alcohol (25:24:1). PRECAUCIÓN: Fenol-cloroformo-isoamyl alcohol es tóxico, mutagénico, corrosivo y peligroso a ambientes acuáticos. Utilizar en una campana de humos, use ropa protectora y guantes y desechar en la basura especial fenol-cloroformo. Mezcla por inversión para 30-60 s y centrifugar durante 5 min a 15.000 x g a temperatura ambiente. Nota: No no un vórtice ADN para evitar la introducción de roturas del filamento al azar, que distorsionaran los resultados. Transferir la fase superior acuosa a un nuevo tubo de 2 mL y añadir 1 V de fenol-cloroformo-isoamyl alcohol (25:24:1). Mezcla por inversión y centrifugar durante 5 min a 15.000 x g a 4 ° C. Transferir fase superior acuosa para un nuevo 2 mL del tubo y añadir 20 μl (5 M) de NaCl y 1 V de isopropanol frío. PRECAUCIÓN: Isopropanol es inflamable, irritante y tóxico. Almacenar en un gabinete ventilado, use guantes y ropa de protección y mantenerlo lejos de las llamas. Mezclar por inversión e incubar durante al menos 1 h a -20 ° C. Centrifugar 20 min a 15.000 x g, 4 º C y desechar sobrenadante. Pellet de ADN lavado con 200 μL frío 70% de etanol, centrifugar durante 20 min a 15.000 x g a 4 º C y descartar el sobrenadante. PRECAUCIÓN: el etanol al 70% es inflamable e irritante. Mantener la solución de trabajo a-20 ° C, otra tienda en gabinete ventilado, llevar ropa protectora y guantes y mantenerse alejado de las llamas. Secar el pellet de ADN a temperatura ambiente durante 20-25 min. ADN disolver en 100 μl TE tampón y las muestras en un tubo de la piscina. Concentración de cuantificar el ADN utilizando un reactivo de cuantificación de dsDNA según fabricante ' Especificaciones de s (véase la Tabla de materiales). Nota: Utilice un reactivo de cuantificación de dsDNA, porque la cuantificación espectrofotométrica de ADN puede ser afectado por fenol residual. Tienda ADN a-20 ° C o continuar con tratamiento HincII. 4. Hidrólisis alcalina y HincII tratamiento Digest 1 μg de ADN en una reacción de combinación que contiene 5 μl 10 x tampón 3.1, 1 μl (10 U) HincII y libre de nucleasas H 2 O a un volumen final de 50 μl. Nota: Para lograr las condiciones óptimas para la ligadura, segunda síntesis de strand y la amplificación de PCR, puede ser necesario aumentar la cantidad de ADN de entrada si se espera que el ADN contiene una cantidad muy baja de ribonucleótidos. Del mismo modo, puede ser necesario disminuir la entrada ADN si el número de ribonucleótidos es muy alto. Incubar durante 30 min a 37 ° C. Purificar HincII tratados ADN con perlas paramagnéticas. Nota: Mantenga el tubo de tapas abierto en los siguientes pasos para no perturbar pelotillas con la apertura de los tubos. Añadir 1.8 V perlas paramagnéticas a cada uno de muestra y mezclar cuidadosamente mediante pipeteo, incubar a temperatura ambiente durante 10 min Utilizar una rejilla magnética para pellets los granos durante 5 minutos, luego retire y deseche el sobrenadante. Lavar el pellet con 150 μL de etanol al 70% (temperatura ambiente) para cerca de 30 s luego quite y descarte el sobrenadante. Lavar el precipitado con 200 μL de etanol al 70% (temperatura ambiente) durante unos 30 s, luego retire y descarte el sobrenadante. Nota: El etanol Residual se puede quitar con una pipeta de 10 μl. Gotas se pueden girar hacia abajo brevemente antes. Secar las muestras a temperatura ambiente durante unos 15-20 minutos Nota: El tiempo exacto depende del volumen de los granos y la forma de la pelotilla, por lo tanto deben comprobarse visualmente los pellets. Retirar los tubos de la rejilla magnética y eluir pellet en 45 μl EB, mezclar mediante pipeteo cuidadosamente. Incubar por 5 min luego los granos en la rejilla magnética de la pelotilla y uso 45 μl de DNA purificado en paso 4.4. Añadir 5 μl de KOH (3 M) o KCl (3 M) del ADN creando un volumen total de 50 μl. PRECAUCIÓN: solución 3 M de KOH es corrosivo. Use ropa protectora y guantes de. Horno incubar por 2 h a 55 ° C en un hibridación seguida de 5 minutos en hielo. Nota: Se recomienda realizar el tratamiento de KOH en un horno en lugar de un bloque de la calefacción para mantener un calentamiento uniforme del tubo y evitar la condensación en la tapa de. Precipitar el ADN agregando acetato de sodio de 10 μl (3 M, pH = 5.2) y 125 μl etanol frío de 100%. Incubar en hielo por 5 min PRECAUCIÓN: el etanol 100% es inflamable e irritante. Un gabinete ventilado, use ropa protectora y guantes y mantenerse lejos de las llamas. Pellets gDNA por centrifugación a 21.000 x g, 4 ° C por 5 min y descarte el sobrenadante. Lavado ADN pellet con 250 μl frío 70% EtOH, Centrifugue a 21.000 x g, 4 ° C por 5 min y descarte el sobrenadante. Nota: Para quitar las gotitas, el tubo se puede girar hacia abajo brevemente otra vez y puede eliminar sobrenadante con una pipeta de 10 μl. Dejó el sedimento seco en un tubo abierto por unos 5-10 min hasta que se evapore cualquier líquido visible. Disuelve de pellet de ADN dejó en 20 μl EB durante 30 min a temperatura ambiente. 5. 5´ fosforilación final preparar la mezcla de reacción para cada muestra por adelantado contraexistente de 2.5 μl 10 x buffer de reacción Polinucleótido quinasa de T4, 1 μl (10 U) 3´-fosfatasa-menos T4 Polinucleótido quinasa y 2,5 μl ATP (10 mM). De transferencia 19 μl de cada ADN de la muestra en un tubo nuevo de 200 μl y desnaturalizar 3 minutos a 85 ° C en un thermo cycler. ADN cool las muestras en hielo y añadir 6 μl de mezcla de reacción para cada muestra. Mezclas de reacción de incubar a 37 ° C por 30 minutos y una parada de la reacción por incubar las muestras a 65 ° C durante 20 min. Purificar ADN como se describe en 4.3, con 1,8 V de perlas paramagnéticas pero eluir en 14 μl EB. 6. ssDNA ligadura preparar la mezcla de reacción para cada muestra compuesta de antemano 0,5 μl ATP (2 mM), 5 μl 10 x buffer de reacción RNA T4 ligasa, 5 μl CoCl 3 (NH 3) 6 mM (10), 0,5 μl ARC140 (100 μm) y 25 μl 50% PEG 8000. Mezclar por pipeteo. PRECAUCIÓN: CoCl 3 (NH 3) 6 es cancerígeno, sensibilización y peligrosas para el medio ambiente acuático. Use ropa protectora y guantes de. Transferencia 13 μl de ADN purificado de paso 5.5 a un tubo nuevo de 200 μl y desnaturalizar 3 minutos a 85 ° C en un thermo cycler. Enfriar el ADN en el hielo y añadir 36 μl de mezcla de reacción para cada muestra, mezclar mediante pipeteo y desactivación brevemente. Agregar 1 μl (10 U) de ARN ligasa de T4 a cada reacción, mezclar mediante pipeteo y girar hacia abajo brevemente. Incubar las muestras a temperatura ambiente en la oscura noche. 7. Síntesis del segundo filamento Purify ligarse DNA como se describe en 4.3, pero uso 0.8 V de perlas paramagnéticas, pellets los granos durante 10 minutos y eluir en 20 μl EB. Nota: Debido a la mayor viscosidad de la mezcla de reacción de la ligadura, el primer paso de granulación se prolonga. Transferencia de 20 μl de muestra de ADN a un tubo nuevo de PCR de 200 μl. Repita el paso de purificación con 0.8 V de granos paramagnéticos siguiendo el fabricante ' Especificaciones de s y eluir en 14 μl EB. Preparar la mezcla de reacción para cada muestra por adelantado que consta de 2 μl de tampón de reacción de la polimerasa de la DNA de 10 x T7, 2 μl de ARC76/77 (2 μm), 2 μl dNTPs (2 mM) y 0,8 μl BSA (1 mg/mL). 12,8 transferir μl purificado ADN a un tubo nuevo de 200 μL, desnaturalizar 3 minutos a 85 ° C en un thermo cycler. Enfriar el ADN en el hielo y añadir 6.8 μl de mezcla de reacción para cada muestra, mezclar mediante pipeteo, desactivación brevemente e incubar 5 min a temperatura ambiente. Añadir 0,4 μL (4 U) T7 DNA polimerasa a cada reacción e incubar 5 min a temperatura ambiente. Purificar ADN como se describe en 4.3, con 0.8 V de perlas paramagnéticas y eluir en EB de 11 μl. 8. Amplificación por PCR y cuantificación de biblioteca Prepare la mezcla de reacción para cada muestra en un nuevo 200 tubo de μl de antemano consistente en 7.5 μl ARC49 (2 μm), cartilla de índice de 7.5 μl (2 μm, único para cada muestra) y 25 μl de 2 x arranque en caliente mezcla listo. Añadir 10 μl de muestra de ADN en cada reacción. Ampliar la biblioteca con las siguientes condiciones: desnaturalizar a 95 ° C por 45 s, seguido por 18 ciclos de 98 ° C durante 15 s, 65 ° C durante 30 s, 72 ° C por 30 s, terminando con una elongación final a 72 ° C por 2 minutos mantenga las muestras a 4 ° C después de la amplificación de. Purificar las bibliotecas como se describe en 4.3, con 0,8 V de perlas paramagnéticas y procederá a la elución en 20 μl de tampón TE. Cuantificar bibliotecas utilizando un reactivo de cuantificación de dsDNA, según el fabricante ' Especificaciones de s (véase la Tabla de materiales). Almacenar las muestras a-20 ° C o continuar con el análisis de la biblioteca. 9. Análisis de la biblioteca y Pooling determinar la calidad de cada biblioteca y estimar el tamaño de fragmento promedio utilizando un sistema de electroforesis digital. Nota: El tamaño del fragmento promedio se evalúa por estimar que el área bajo la curva del electroferograma es reducido a la mitad, haciendo caso omiso de picos de los marcadores. Resultados representativos de los perfiles de biblioteca adecuado tras el tratamiento KOH o KCl se dan en la figura 2A. Calcular la concentración (nM) de las bibliotecas como: /(p*650) (c/10 3)] * 10 9 donde c es la concentración de la biblioteca en ng/μl y p es el tamaño de fragmento promedio en bp, como estimado en 9.1. Piscina molares cantidades iguales de hasta 24 bibliotecas amplificadas con iniciadores de diferente índice de secuenciación. Añadir buffer TE a un volumen final de 25 μl y la concentración de 10 nM. Nota: Dependiendo del número de bibliotecas para combinarse, se ajusta la cantidad de ADN de cada biblioteca. Si se detectaron dímeros de primer paso 9.1 como un pico distinto de unos 130 bp, el volumen final de la piscina de la biblioteca puede superar los 25 μl, ya que el paso de purificación se repite como se describe en 4.3, con 0,8 V de perlas paramagnéticas, y ADN se eluyó en 25 μl TE buf Fer. Determine la concentración de piscina biblioteca nueva utilizando un reactivo de cuantificación de dsDNA según fabricante ' Especificaciones de s y el promedio máximo tamaño como se describe anteriormente. Proceder a la secuenciación y análisis de datos (secciones 10 y 11). 10. Secuencia realizar secuenciación del extremo apareado 75-base en bibliotecas combinado 12. 11. Análisis de datos Trim todas las lecturas para eliminar secuencias de adaptador de filtro para la calidad y leer longitud. Nota: Esto puede hacerse usando cutadapt 1.2.1 20 con el comando ‘ cutadapt -f fastq – partido-leer-comodines–tranquilo -m 15 – q 10 – un NNNNNNN < archivo >’, donde NNNNNNN se sustituye por la secuencia del adaptador real y < archivo > es reemplazado con el nombre del fichero fastq. Eliminar compañeros de lecturas que fueron descartadas en el paso anterior utilizando secuencias de comandos personalizadas. Pares de alinear Mate 1 de restantes a un índice que contiene la secuencia de los oligonucleótidos utilizados en la preparación de la biblioteca (e.g., usando corbatín 0.12.8 21 y la línea de comandos opciones – m1-v2). Deseche todos los pares con alineaciones exitosas. Alinear pares restantes en el genoma de referencia de organismo con corbatín de la línea de comandos opciones – v2 -X 10000–mejor. Mapa Lee eso palmo entre mitocondrial molécula inicial y final alineando Mate 1 de todos los pares de no alineados (con pajarita de la línea de comandos opciones – v2). Determinar el recuento de fin de 5´ para todos alineaciones de la final individuales y pareadas. Desplace la posición de éstos por uno base aguas arriba hasta la posición donde estaban los ribonucleótidos hidrolizados. Exportar datos desde el archivo de bowtie formato a un formato de archivo bedgraph usando scripts personalizados para visualización en común browsers del genoma. Normalizar las lecturas para cada filamento a Lee por millones. Usando la posición y el conteo desde el archivo bedgraph, referencia la secuencia del genoma del organismo para determinar la identidad de incorpelaboradas ribonucleótidos. Nota: Para el genoma mitocondrial humano Lee de las regiones 16.200-300 y 5.747-5.847 de cada hebra debe excluirse ya que estas regiones contienen muchos 5´-extremos libres, no relacionadas con la incorporación de ribonucleótido por ADN polimerasa γ. Dividir la Lee total, no incluye lecturas en los once sitios de HincII, con el número promedio de lecturas por sitio HincII para obtener el número de ribonucleótidos por rotura de la hebra, (es decir, el número de ribonucleótidos por molécula mitochondrial).