Mapeamento simultâneo e quantificação de ribonucleotídeos no DNA mitocondrial humano

este protocolo é descrito na Figura 1 e inclui o isolamento de gDNA, digestão com enzimas de restrição para ser capaz de quantificar o número de ribonucleotídeos, tratamento com álcali para hidrolisar as ligações fosfodiéster de ribonucleotídeos incorporada a gDNA, fosforilação das extremidades livre 5´-OH, ssDNA ligadura dos adaptadores, segunda vertente de síntese e amplificação por PCR antes sequenciamento. 1. índice de Primers e adaptadores ARC49 obter, ARC140 oligonucleotides, ARC76/77, adaptador e ARC78-ARC107 as primeiras demão índice (ver tabela 1). Nota: Oligonucleotides devem ser purificado de HPLC. ARC76/77 são ordenados como duplex. Preparar 100 µM as soluções de cada oligonucleotide em tampão Tris-EDTA (TE) (consulte a Tabela de materiais) e armazenar a -20 ° C. Soluções de soluções de preparar 10 µM de ARC67/77 e 2 µM de primers ARC49 e índice diluindo em tampão de eluição (EB; consulte a Tabela de materiais). Loja a-20 ° C. 2. Crescimento e colheita de células células HeLa crescer em 70 mL Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal em um balão de 250 mL Spinner em 37 ° C. Contar o número de células e coletar 5 x 10 6 células em um tubo de 50 mL, centrifugar por 5 min a 200 x g e descartar o sobrenadante. Lavar as células com 20 mL 1X PBS, centrifugar por 5 min a 200 x g e descartar o sobrenadante. Congelar as bolinhas a-20 ° C ou continuar com a purificação de DNA. 3. Purificação de DNA e quantificação purificar gDNA usando extração fenol-clorofórmio, conforme descrito abaixo. Ressuspender as células em 2 mL de tampão de lise (consulte a Tabela de materiais) e incube por 30 min a 42 ° C em um bloco de aquecimento. Cuidado: Lise contém componentes perigosos. Solução de SDS é irritante, Proteinase K é tóxico, irritante e sensibilização. Use roupas protetoras e luvas. Dividir a amostra em dois tubos de 2 mL e adicionar 1 volume (V) de álcool isoamílico-fenol-clorofórmio (25:24:1). Cuidado: O álcool isoamílico-fenol-clorofórmio é tóxicos, mutagênicos, corrosivos e perigosos para ambientes aquáticos. Use em uma coifa, usar roupas protetoras e luvas e descarte de resíduos especiais de fenol-clorofórmio. Mix por inversão para 30-60 s e centrifugar durante 5 min à 15.000 x g à temperatura ambiente. Nota: Fazer não vórtice DNA para evitar a introdução de quebras aleatórias, que iria distorcer os resultados. Transferir a fase aquosa, superior para um novo tubo de 2 mL e adicionar 1 V de álcool isoamílico-fenol-clorofórmio (25:24:1). Mix por inversão e centrifugar durante 5 min à 15.000 x g a 4 ° C. Transferir a fase aquosa, superior para um novo 2 mL tubo e adicionar 20 µ l NaCl (5 M) e 1 V de isopropanol frio. Atenção: O Isopropanol é inflamável, irritante e tóxico. Armazená-lo em um gabinete ventilado, usar roupas protetoras e luvas e mantê-lo afastado de chamas. Mix por inversão e incubar durante pelo menos 1 h a -20 ° C. Centrífuga por 20 min em 15.000 x g, 4 ° C e descartar sobrenadante. Pellet de DNA de lavagem com 200 µ l 70% álcool etílico frio, centrifugar por 20 min a 15.000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Atenção: 70% de etanol é inflamável e irritante. Manter a solução de trabalho em-20 ° C, caso contrário loja no armário ventilado, roupas protetoras e luvas e mantê-lo afastado de chamas. Secar o sedimento de DNA à temperatura de 20-25 min. Pelotas de DNA dissolver em 100 µ l de TE do buffer e as amostras em um tubo do pool. Concentração de DNA dosar usando um reagente de quantificação de dsDNA de acordo com o fabricante ' s especificações (ver a Tabela de materiais). Nota: Usar um reagente de quantificação de dsDNA, como quantificação espectrofotométrica do DNA pode ser afectada por fenol residual. DNA loja a-20 ° C ou continuar com o tratamento de HincII. 4. Hidrólise alcalina e tratamento de HincII Digest 1 µ g de DNA em uma reação de mistura contendo 5 µ l 10x buffer 3.1, 1 µ l (10 U) HincII e livre de nuclease H 2 O, até um volume final de 50 µ l. Nota: Para conseguir condições óptimas para ligadura, segunda vertente de síntese e amplificação por PCR, pode ser necessário aumentar a quantidade de DNA de entrada se espera-se que o ADN contém um número muito baixo de ribonucleotídeos. Da mesma forma, pode ser necessário diminuir a entrada de DNA se o número de ribonucleotídeos é muito alto. Incubar durante 30 min a 37 ° C. HincII purificar tratados DNA com grânulos paramagnéticos. Nota: Mantenha o tubo tampas abrir nas etapas a seguir para não perturbar pelotas abrindo os tubos. Adicionar 1,8 V de grânulos paramagnéticos para cada amostra, misturar cuidadosamente pipetando e incubar à temperatura ambiente durante 10 min. Usar um rack magnético para granular os grânulos por 5 min, em seguida, remover e descartar o sobrenadante. Lavar a pelota com 150 µ l de etanol 70% (temperatura ambiente) para cerca de 30 s em seguida, remover e descartar o sobrenadante. Lavagem a pelota com 200 µ l de etanol 70% (temperatura ambiente) por cerca de 30 s, então, remover e descartar o sobrenadante. Nota: Etanol Residual pode ser removido com uma pipeta de 10 µ l. As gotas podem ser giradas para baixo brevemente antes. Secar as amostras em temperatura ambiente por cerca de 15-20 min. Nota: O tempo exato depende do volume dos grânulos e a forma da pelota, portanto, as pastilhas devem ser verificadas visualmente. Remover tubos de rack magnético e eluir a pelota em µ l 45 EB, mistura pipetando cuidadosamente. Incubar por 5 min então granular os grânulos no rack magnético e use 45 µ l de DNA purificado na etapa 4.4. Adicionar 5 µ l de KOH (3 M) ou KCl (3 M) com o DNA criando um volume total de 50 µ l. Cuidado: solução de KOH M 3 é corrosivo. Use roupas protetoras e luvas. Forno de incubar durante 2 h a 55 ° C em uma hibridação seguido por 5 min no gelo Nota: Recomenda-se realizar o tratamento de KOH em um forno, ao invés de um bloco de aquecimento para manter um aquecimento uniforme do tubo e impedir a condensação na tampa. DNA precipitado pela adição de acetato de sódio 10 µ l (3 M, pH = 5,2) e 125 µ l 100% álcool etílico frio. Incubar no gelo por 5 min. Atenção: 100% de etanol é inflamável e irritante. Armazenar em um gabinete ventilado, usar roupas protetoras e luvas e manter afastado de chamas. GDNA de pelotas por centrifugação a 21.000 x g, 4 ° C por 5 min e descartar o sobrenadante. Lavagem DNA pelota com 250 µ l frio 70% EtOH, centrifugar a 21.000 x g, 4 ° C por 5 min e descartar o sobrenadante. Nota: Para remover as gotas, o tubo pode ser girado para baixo, brevemente novamente e sobrenadante pode ser removido com uma pipeta de 10 µ l. Deixar o sedimento secar em um tubo aberto por cerca de 5-10 min até visível todo o líquido tenha evaporado. DNA deixa pelota dissolvê-los em 20 µ l EB por 30 min à temperatura ambiente. 5. 5´ final fosforilação preparar a mistura de reação para cada amostra antecipadamente contrasome de 2,5 µ l 10 x T4 amortecedor da reação da quinase polinucleotídicas, 1 µ l (10 U) 3´-fosfatase-menos T4 polinucleotídicas da quinase e 2,5 µ l ATP (10 mM). Transferência 19 µ l de cada DNA para um novo tubo de 200 µ l da amostra e desnaturar por 3 min a 85 ° C em um thermo-cycler. Cool DNA amostras no gelo e adicione 6 µ l da mistura de reação para cada amostra. Mistura de reação de incubar a 37 ° C por 30 min e parar a reação incubando-se as amostras a 65 ° C por 20 min. Purificar DNA como descrito no ponto 4.3, usando 1.8 V dos grânulos paramagnéticos mas eluir em µ l 14 EB. 6. ssDNA ligadura preparar a mistura de reação para cada amostra antecipadamente consistindo de 0.5 µ l ATP (2 mM), 5 µ l 10 x amortecedor da reação do RNA T4 ligase, 5 µ l CoCl 3 (NH 3) 6 (10 mM), 0,5 µ l ARC140 (100 µM) e 25% de 50 µ l PEG 8000. Mistura bem pipetando. Atenção: CoCl 3 (NH 3) 6 é cancerígeno, sensibilização e perigosas para o ambiente aquático. Use roupas protetoras e luvas. Transferência 13 µ l de DNA purificado de passo 5.5 para um novo tubo de 200 µ l e desnaturar por 3 min a 85 ° C em um thermo-cycler. Legal o DNA no gelo e adicione 36 µ l da mistura de reação para cada amostra, misturar pipetando spin para baixo brevemente. Adicionar 1 µ l (10 U) de T4 Ligase de RNA para cada reação, misturar pipetando e spin para baixo brevemente. Incubar as amostras à temperatura ambiente na noite escura. 7. Síntese segundo-Costa Purify ligado DNA, conforme descrito no ponto 4.3, mas usar 0,8 V de grânulos paramagnéticos, granular os grânulos por 10 min e eluir em 20 µ l EB. Nota: Devido à maior viscosidade da mistura de reação da ligadura, a primeira etapa de granulação é prolongada. Transferência de 20 µ l de amostra de DNA para um novo tubo de PCR de 200 µ l. Repita a etapa de purificação usando 0.8 V de grânulos paramagnéticos seguindo o fabricante ' s especificações e eluir em µ l 14 EB. Preparar a mistura de reação para cada amostra antecipadamente consistindo de 2 µ l de 10 x T7 DNA polimerase amortecedor da reação, 2 µ l ARC76/77 (2 µM), 2 µ l dNTPs (2 mM) e 0,8 µ l BSA (1 mg/mL). µ L 12,8 transferir purificado DNA para um novo tubo de 200 µ l, desnaturar por 3 min a 85 ° C em um thermo-cycler. Legal o DNA no gelo e adicionar 6,8 µ l da mistura de reação de cada amostra, misturar pipetando, spin para baixo rapidamente e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. Adicionar 0,4 µ l (4 U) T7 DNA polimerase para cada reação e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. Purificar DNA como descrito no ponto 4.3, usando 0.8 V de grânulos paramagnéticos e eluir em 11 µ l EB. 8. Amplificação por PCR e quantificação da biblioteca tubo de Prepare a mistura de reação para cada amostra em um novo 200 µ l antecipadamente consistindo de 7,5 µ l ARC49 (2 µM), primeira demão de índice 7,5 µ l (2 µM, exclusivo para cada amostra) e 25 µ l 2 x começo quente mistura pronta. Adicionar 10 µ l de amostra de DNA para cada reação. Amplificar a biblioteca usando as seguintes condições: desnaturar a 95 ° C por 45 s, seguido de 18 ciclos de 98 ° C por 15 s, 65 ° C por 30 s, 72 ° C por 30 s, terminando com um alongamento final a 72 ° C para amostras de espera de 2 min. a 4 ° C após amplificação. Purificar bibliotecas conforme descrito no ponto 4.3, usando 0.8 V de grânulos paramagnéticos e eluir no buffer de TE 20 µ l. Dosar bibliotecas usando um reagente de quantificação de dsDNA, de acordo com o fabricante ' s especificações (ver a Tabela de materiais). Armazenar amostras a-20 º C ou continuar com a análise de biblioteca. 9. Análise de biblioteca e de determinar a qualidade de cada biblioteca e estimar o tamanho do fragmento média usando um sistema de eletroforese digital. Nota: O tamanho do fragmento média é avaliado pela estimativa onde a área sob a curva da electroferograma é reduzido a metade, desconsiderando a picos de marcadores. Resultados representativos dos perfis de biblioteca apropriada após tratamento KOH ou KCl são dadas na Figura 2A. Calcular a concentração (nM) das bibliotecas como: /(p*650) (c/10 3)] * 10 9 onde c é a concentração da biblioteca em ng / µ l e p é o tamanho do fragmento média na bp, como estimado em 9.1. Piscina molares quantidades iguais de até 24 bibliotecas amplificadas com primers de índice diferente para sequenciamento. Adicionar tampão TE para um volume final de 25 µ l e concentração de 10 nM. Nota: Dependendo do número de bibliotecas seja agrupado, é ajustar a quantidade de DNA de cada biblioteca. Se dímeros cartilha foram detectados na etapa 9.1 como um distinto pico de cerca de 130 bp, o volume final da biblioteca piscina pode exceder 25 µ l, porque a etapa de purificação é repetida, conforme descrito no ponto 4.3, usando 0.8 V de grânulos paramagnéticos, e DNA é eluída em 25 µ l TE buf Fer. Determinar a concentração de piscina nova biblioteca usando um reagente de quantificação de dsDNA de acordo com o fabricante ' s especificações e a média de pico tamanho conforme descrito acima. Prossiga para sequenciamento e análise de dados (capítulo 10 e 11). 10. Sequenciamento de realizar 75-base emparelhado-final sequenciamento em bibliotecas em pool 12. 11. análise de dados Trim todas as leituras para remover sequências de adaptador, filtro para qualidade e leia o comprimento. Nota: Isto pode ser feito usando cutadapt 1.2.1 20 com o comando ‘ cutadapt -f fastq – jogo-leitura-curingas – silêncio – 15 m – q 10 – um NNNNNNN < arquivo >’, onde NNNNNNN é substituído com a sequência de adaptador real e < arquivo > é substituído com o nome do arquivo fastq. Remover companheiros de leituras que foram descartados no passo anterior usando scripts personalizados. Pares de alinhar o companheiro 1 do restante a um índice que contém a sequência de todos os oligonucleotídeos utilizados para a preparação de biblioteca (por exemplo, usando Bowtie 0.12.8 21 e a linha de comando opções – m1-v2). Elimine todos os pares com alinhamentos bem sucedidos. Alinhar pares restantes para o genoma de referência de organismo usando gravata borboleta com a linha de comando opções – v2 -X 10000..–melhor. Mapa lê esse intervalo entre a molécula mitocondrial começo e fim, alinhando 1 companheiro de todos os pares desalinhados (usando gravata borboleta com a linha de comando opções – v2). Determinar a contagem de fins-de-5´ para todos os alinhamentos de fim único e emparelhados. Mude a posição destes por um base montante para a posição onde estavam os hidrolisado ribonucleotídeos. Dados de exportação do arquivo bowtie formato em um formato de arquivo de bedgraph usando scripts personalizados para visualização em comum navegadores do genoma. Normalizar as leituras para cada vertente de leituras por milhões. Usando a posição e contagens do arquivo bedgraph, referência a sequência genômica do organismo, para determinar a identidade do incorpditado ribonucleotídeos. Nota: Para o genoma mitocondrial humano lê das regiões 16.200-300 e 5.747-5.847 para cada vertente deve ser excluído desde que estas regiões contêm muitos 5´-extremidades livres, não relacionados à incorporação ribonucleótido pela DNA polimerase γ. Dividir o lê total, não incluindo leituras dos onze locais de HincII, com o número médio de leituras por HincII site para obter o número de ribonucleotídeos por intervalo único filamento, (ou seja, o número de ribonucleotídeos por molécula mitocondrial).